تصور ثلاثي الأبعاد للخلايا الوعائية الشبكية في الفئران عن طريق التلوين المناعي

يتمثل نطاق هذا البحث في دراسة التشكل والتوزيع المكاني للطفيليات في الأوعية الدموية الشبكية باستخدام تقنيات التصوير المتقدمة. من أجل تقديم عرض مفصل لتوضيح الخصائص المورفولوجية للطفيليات ، وصفت الدراسة نهجا جديدا يجمع بين الحقن الرجعي للحجاج لعامل الفلورسنت ، وتلوين الفلورسنت المناعي ، وعلاج إزالة الأنسجة لتعزيز البحث في مجالنا.

بالمقارنة مع حالة ما قبل التطهير لأنسجة شبكية الفأر ، يتم تقليل إشارات الخلفية للأوعية الدموية والطفيليات المسماة بلاكتين الطماطم الفلورية و PDGFR-beta بشكل كبير بعد تطهير الأنسجة ، مما يسهل مراقبة أكثر دقة لعلاقتها المكانية.

تشير نتائجنا إلى أن هذه التقنيات متوافقة للغاية لإظهار الطفيليات في الأوعية الدموية الشبكية في شبكية العين بأكملها. يعد الجمع بين هذه التقنيات النسيجية نهجا فعالا لتصور الخصائص المورفولوجية للطفيليات بالتفصيل من وجهة نظر ثلاثية الأبعاد.

[مدرب] للبدء ، ضع الفأر المخدر في الاستلقاء الجانبي الأيمن مع توجيه رأسه إلى اليسار. اضغط برفق بإصبعين على المنطقة المحيطة بالحجاج لكشف العين اليسرى للفأر. باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 27 ، اخترق برفق حوالي ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات في الجيوب الأنفية الوريدية المدارية ، مما يضمن أن شطبة الإبرة متجهة للأمام بزاوية 45 درجة. حقن 0.1 مل من لاكتين الطماطم الفلورية في الجيوب الأنفية الوريدية المدارية. بعد خمس دقائق من الحقن خلف الحجاج ، قتل الفأر واستخدم المقص الجراحي لفتح التجويف الصدري. أدخل إبرة قياس 24 ملليمترين في البطين القلبي الأيسر من خلال قمة البطين الأيسر. قم بإجراء التروية بمعدل ثلاثة ملليلتر في الدقيقة مع 20 مل من محلول ملحي فسيولوجي 0.9٪ ، متبوعا ب 20 مل من محلول ملحي فسيولوجي بنسبة 4٪. حقن 0.1 ملليلتر من 0.9٪ فورمالديهايد في عازلة فوسفات 0.1 مولار. بعد ذلك ، ضع الفأر المضحى به على جانبه وقم بإزالة الجلد الذي يغطي العينين بالمقص. استئصال العينين بالمقص والملقط. قطع العصب البصري والأنسجة المحيطة به ورفع العين. انقل العين إلى صفيحة 12 بئرا لتثبيتها في 4٪ فورمالديهايد في محلول فوسفات 0.1 مولار لمدة ساعتين. بعد التثبيت ، قم بالتبريد بحماية العين في 25٪ سكروز في محلول فوسفات 0.1 مولار عند أربع درجات مئوية حتى تغرق في قاع المحلول. باستخدام ماصة القس البلاستيكية ، انقل العين إلى طبق بتري يحتوي على 0.1 عازلة فوسفات مولارية. اخترق حافة القرنية بمقص حاد ، وقطع حول القرنية والقزحية ، وتخلص منها. باستخدام الملقط ، قم بإزالة العدسة والخلط الزجاجي. بعد ذلك ، استخدم ملقطا دقيقا لسحب شبكية العين على شكل كوب بعيدا عن مركز العين. اشطف شبكية العين بمحلول فوسفات 0.1 مولار في طبق بتري نظيف. بعد عزل شبكية الفأر على شكل كوب ، قم باحتضانها في حاضنة لمدة 20 ساعة بمحلول Triton X-100 بنسبة 2٪ في محلول فوسفات 0.1 مولار طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، انقل شبكية العين إلى محلول الحجب وقم بتدويره بسرعة 72 دورة في الدقيقة على الخلاط طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، ضع شبكية العين في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على الأجسام المضادة الأولية لبيتا الماعز المضاد ل PDGFR في المخزن المؤقت للتخفيف. قم بتدوير الأنبوب على شاكر لمدة يومين عند أربع درجات مئوية. بعد يومين ، اغسل شبكية العين مرتين باستخدام عازلة الغسيل في درجة حرارة الغرفة. ضع شبكية العين في مخزن الغسيل وانقلها إلى الخلاط طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، انقل شبكية العين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على محلول واحد ملليغرام لكل مليلتر من الجسم المضاد الثانوي للحمار المضاد للماعز 488 و 0.2 نانوجرام لكل مليلتر صبغة نووية فلورية DAPI. قم بتدوير الأنبوب الموجود على شاكر بسرعة 72 دورة في الدقيقة لمدة خمس ساعات عند أربع درجات مئوية. اغسل شبكية العين في طبق من ستة آبار مع محلول غسيل لمدة ساعة مرتين في درجة حرارة الغرفة. احتضان شبكية العين في مخزن الغسيل على الخلاط طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، انقل شبكية العين إلى كاشف تنظيف الأنسجة وقم بتدويرها برفق على الخلاط عند 60 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد إزالة الأنسجة ، اشطف شبكية العين بمحلول فوسفات 0.1 مولار في طبق بتري نظيف. باستخدام مقص الزنبرك ، قم بعمل أربعة شقوق شعاعية تصل إلى حوالي 2/3 من نصف قطر شبكية العين لإنشاء شكل بتلة. افرد شبكية العين وقم بتثبيتها على شريحة مجهرية بحيث يكون الجزء الداخلي من شبكية العين متجها لأعلى. استخدم قطعة صغيرة من الورق الماص لإزالة أي عازلة زائدة للفوسفات. ضع دائرة حول شبكية العين المثبتة بفاصل. املأ الفجوة بكاشف تنظيف الأنسجة الطازجة وضع زلة غطاء في الأعلى. امسح مناظر المونتاج لشبكية العين المسماة باستخدام الماسح الضوئي البانورامي لشرائح المناديل. التقط صورا مكبرة أعلى باستخدام نظام تصوير مزود بعدسة 2X و 10X بفتحات عدمية تبلغ 0.40 و 0.95 على التوالي. التقط صورا مكدسة 50Z من شبكية العين المسماة في إطارين ميكرومتريين. انقر بالتتابع فوق Set Start Focal Plane و Set End Focal Plane و Set Step Size واختر Depth Pattern و Image Capture و Z-Series لدمج جميع الصور في صورة واحدة تحت التركيز البؤري باستخدام وضع الإسقاط والتضاريس. بعد ذلك ، التقط صورا باستخدام التألق الأخضر عند 499 و 519 نانومتر ، والتألق الأحمر عند 591 و 618 نانومتر ، والتألق الأزرق عند 401 و 421 نانومتر. حدد إضافة أسطح جديدة بالتسلسل، واختر إعدادات مستوى الصوت، واختر قناة المصدر، واضبط الشاشة، واضبط زاوية السطح، ولقطة لاستيراد الصور متحدة البؤر Z-Stack إلى برنامج التحليل، وإعادة بناء الصور في النمط ثلاثي الأبعاد. زادت شفافية الأنسجة لشبكية العين بأكملها بعد علاج تطهير الأنسجة مقارنة بشبكية العين دون تطهير الأنسجة. كانت الأوعية الدموية الشبكية المسماة بليكتين الطماطم وطفيليات الشبكية المسماة ب PDGFR-β مرئية قبل وبعد إزالة الأنسجة ، ولكن تم تقليل ضوضاء الخلفية بعد إزالة الأنسجة. لوحظت طفيليات الشبكية على طول شجرة الأوعية الدموية ، مما يدل على توزيع تدرج من المناطق المركزية إلى المناطق الطرفية لشبكية العين. أظهرت صور Z-Stack ثلاثية الأبعاد من شبكية العين التي تم تطهيرها طفيليات ملفوفة بإحكام حول أوعية الشبكية بأقطار متفاوتة مع تلطيخ PDGFR-β أقوى في الشعيرات الدموية.