الضربة القاضية الجينية بوساطة CRISPR-Cas9 القائمة على التثقيب الكهربائي في خلايا THP-1 وعزل استنساخ الخلية المفردة

يركز نشاطي البحثي على فهم الآليات التي تجعل البلاعم مقاومة للعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية ، الفيروس المسؤول عن جائحة الإيدز. على وجه الخصوص ، نركز على نشاط الإنزيم الذي يسمى بعض HT-1 الذي يحلل NTPs ، اللبنات الأساسية للجينومات الفيروسية. لكن لهذا الإنزيم أيضا أنشطة أخرى نحاول توضيحها.

أنشأنا بروتوكولا للهندسة الوراثية لخلايا THP1. هذه الخلايا هي بديل راسخ للبلاعم البشرية لدراستها. على سبيل المثال ، تكرار فيروس نقص المناعة البشرية -1.

يصعب نقل هذه الخلايا للتلاعب بمحتواها من البروتين. لذلك ، نؤسس طرقا لمعالجة الجينوم باستخدام تقنية CRISPR-Cas9. من تصميم SG RNAs حتى التحقق من صحة المجموعات متعددة النسيلة وحيدة النسيلة.

يهدف بروتوكولنا إلى تحقيق تحرير عالي الكفاءة لجين ذي أهمية في خلايا THP1 التي سيتم تكوينها بالكهرباء بمجمعات البروتين النووي الريبي المجمعة مسبقا التي تصنعها الحمض النووي الريبي لطاقة نوكلياز Cas9. في هذا النهج ، يكون نشاط Cas9 محدودا زمنيا. هذا يقلل من إمكانية توليد التأثيرات المستهدفة التي تنشأ غالبا عند استخدام نواقل العدس.

وفي هذه الحالة ، في الواقع تعبير Cas9 يطيل الوقت وبالتالي يمكن أن يكون ضارا للخلية. للبدء ، املأ كل بئر من صفيحة استزراع 24 بئرا ب 500 ميكرولتر من وسط RPMI 1640 بدون مضاد حيوي واستكمل بنسبة 20٪ من FBS المعطلة والمفلترة للحرارة. ضع الطبق في حاضنة رطبة طوال الليل.

لإعادة ترطيب الدليل الفردي الجاف أو sgRNAs إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومولار ، أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE لكل نانومول واحد من sgRNA. قم بتدوير المحلول لمدة 30 ثانية واحتضانه عند أربع درجات مئوية طوال الليل لضمان الجفاف الكامل. في اليوم التالي ، لتحضير محلول sgRNA العامل 30 ميكرومولار ، قم أولا بتجانس محلول sgRNA 100 ميكرومولار لفترة وجيزة باستخدام ماصة ، ثم قم بتخفيف الساق في الماء الخالي من النوكلياز.

دوامة المحلول لمدة 30 ثانية واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. قم بتخفيف ميكرولتر واحد من كل من الثلاثة ، و 30 محاليل عمل sgRNA ميكرومولار و 0.5 ميكرولتر من محلول Cas9 20 ميكرومولار في 3.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق R ، لتجميع البروتينات النووية الريبية Cas9 sgRNA تضيف نسبة واحدة إلى تسعة مولار. دوامة لفترة وجيزة واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

لإعداد عنصر تحكم غير معدل ، أضف 0.5 ميكرولتر من محلول Cas9 20 ميكرومولار إلى 6.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق R.Vortex لفترة وجيزة واحتضانه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، أضف خمسة ميكرولترات من مخزن إعادة التعليق R إلى العينات لتحقيق حجم نهائي يبلغ 12 ميكرولتر لكل حالة تثقيب كهربائي. لتحضير خلايا THP-1 بعد عد الخلايا ، اجمع حجما يعادل 0.2 في 10 أس ستة من خلايا THP-1 وقم بطردها عند 336G لمدة خمس دقائق عند 20 درجة مئوية ، وشفط المادة الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 12 ميكرولترا من محلول البروتين النووي الريبي.

لإعداد نظام التثقيب الكهربائي ، ضع محطة الماصة أسفل خزانة السلامة الحيوية وقم بوضع أنبوب التثقيب الكهربائي داخل الخزانة ، وأضف ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت E من مجموعة التثقيب الكهربائي إلى أنبوب التثقيب الكهربائي. قم بتشغيل جهاز التثقيب الكهربائي واستخدم شاشة اللمس لضبط معلمات التثقيب الكهربائي ، الجهد على 1 ، 500 فولت. المدة تصل إلى 10 مللي ثانية.

والعدد إلى ثلاثة. جهز ماصة التثقيب الكهربائي بطرف واستنشق 10 ميكرولترات من محلول البروتين النووي الريبي THP-1. أدخل الماصة في أنبوب التثقيب الكهربائي واضغط على شاشة بدء التشغيل على شاشة جهاز التثقيب الكهربائي.

انتظر حتى تظهر الرسالة كاملة وقم بإزالة الماصة من الأنبوب. انقل خلايا THP-1 إلى بئر من لوحة الثقافة المسخنة مسبقا 24 بئر وقم بتجانس العينة برفق. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة المرطبة واترك الخلايا ترتاح دون إزعاج لمدة 72 ساعة.

بعد التثقيب الكهربائي وعد الخلايا ، اسحب حجما يعادل 0.1 في 10 أس ست خلايا THP-1 في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 336G لمدة خمس دقائق عند 20 درجة مئوية وشفط المادة الطافية قبل تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS. مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي للخلايا ، واستنشق أكبر قدر ممكن من المواد الطافية دون إزعاج الحبيبات والمفاجئة ، وتجميد الحبيبات.

لاستخراج الحمض النووي الجيني ، قم بإعادة تعليق الحبيبات ب 50 ميكرولتر من محلول استخراج الحمض النووي. قم بتجانسها ونقل الحجم بالكامل إلى أنبوب PCR سعة 0.2 مل. دوامة الأنبوب والطرد المركزي لفترة وجيزة لنبض ثلاث ثوان.

ضع الأنبوب في جهاز تدوير حراري وقم بتسخينه على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، متبوعا ب 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتخفيف الحمض النووي المستخرج ب 90 ميكرولترا من الماء عالي النقاء والدوامة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة عند 5000 جرام لمدة ثلاث ثوان. قم بتخفيف برايمر PCR في ماء فائق النقاء إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومول.

تحضير مزيج PCR في أنبوب PCR سعة 0.2 مل. ضع أنابيب PCR في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل البرنامج بالإعدادات المحددة. للمجموعات متعددة النسيلة المعدلة في أنبوب جديد 0.2 ملليلتر.

امزج 17.5 ميكرولتر من أمبليكون PCR مع ميكرولترين من E buffer اثنين للحصول على حجم نهائي يبلغ 19.5 ميكرولتر. دوامة المحلول وجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة ، بدلا من ذلك ، لفحص المستنسخة أحادية الخلية ، تخلط منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلايا التحكم المعدلة وغير المحررة بنسبة واحد إلى واحد. لتشكيل الازدواج غير المتجانس ، ضع الأنابيب في جهاز تدوير حراري وقم بتشغيل البرنامج المحدد.

بعد تكوين الازدواج غير المتجانس ، أضف 0.5 ميكرولتر من T سبعة نوكلياز داخلي ، محلول واحد إلى الأنبوب واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لتحضير عينات الرحلان الكهربائي للهلام ، امزج خمسة ميكرولترات من نوكلياز داخلي T7 منتج هضم واحد أو منتج PCR غير مهضوم مع خمسة ميكرولتر من الماء وميكرولترين من ستة صبغة تحميل xDNA ، وقم بتحميل العينات وسلم الحجم في الجل وقم بتشغيل الجل عند 80 فولت لمدة 45 دقيقة. أدى التحرير الجيني بوساطة CRISPR Cas9 لموضع EGFP إلى انخفاض حاد في الخلايا الإيجابية ل GFP لتصل إلى أكثر من 90٪ من الانخفاض بحلول اليوم السابع بعد التثقيب الكهربائي.

بحلول اليوم الثالث بعد التثقيب الكهربائي ، انخفضت أعداد الخلايا إلى النصف بسبب الإجهاد الناجم عن التثقيب الكهربائي ، ولكنها تعافت تماما بحلول اليوم السابع في وسط RPMI الكامل. أظهر الرحلان الكهربائي للهلام T7 على سبيل المثال فقدان ما يقرب من 75 شظية زوج أساسي في الخلايا المحررة مما يؤكد تحرير كريسبر للموقع المستهدف EGFP.