توليد كرويات من الخلايا الغضروفية المختلفة باستخدام ظروف منخفضة الالتصاق تحت الجاذبية والمفاعلات الحيوية الصغيرة محلية الصنع

يتطلب إصلاح الغضروف في أمراض المفاصل المزمنة علاجات متقدمة قائمة على الخلايا لتجديد الأنسجة التالفة بكفاءة. يوفر هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لتمييز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى كرويات قائمة على الخلايا الغضروفية ، مما يدعم هندسة الأنسجة وتطبيقات العلاج الخلوي. يتطلب إصلاح الغضروف في أمراض المفاصل المزمنة علاجات متقدمة قائمة على الخلايا لتجديد الأنسجة التالفة بشكل كاف.

يوفر هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لتمييز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى كرويات قائمة على الخلايا الغضروفية ، مما يدعم هندسة الأنسجة وتطبيقات العلاج الخلوي. تتمثل التحديات الرئيسية في تقليل تعبير الكولاجين من النوع الأول في الخلايا المشتقة من iPSC لمنع الغضروف الليفي ، وخلق الظروف لتكوين الغضروف الناضج ، وتحسين طرق الاستزراع ثلاثية الأبعاد لاستقرار الكرة ، وتطوير مناهج قابلة للتطوير لإنتاج أحجام سريرية من المواد الخلوية. يوفر البروتوكول ميزة باستخدام iPSCs كمصدر بديل للخلايا الغضروفية, السماح بإنتاج قابل للتطوير دون إجراءات جراحية.

إنه يضمن صيانة أفضل للنمط الظاهري للخلايا الغضروفية من خلال الزراعة ثلاثية الأبعاد ، ويحاكي تطور الغضاريف الطبيعية ، مما ينتج عنه خلايا تشبه إلى حد كبير الخلايا الغضروفية الأصلية مع تعبير عال عن العلامات الخاصة بالغضاريف. تطوير طرق فعالة لتعزيز نضج الخلايا الغضروفية المشتقة من iPSC ووظائفها ، وضمان الاستقرار طويل الأمد في الجسم الحي ، وإنشاء مواد ثقافة ثلاثية الأبعاد ليفية ، وتطوير إنتاج قابل للتطوير للمواد الخلوية للتطبيق السريري. للبدء ، قم بتعقيم المقص في الأوتوكلاف المضبوط على 121 درجة مئوية عند 15 رطلا لكل بوصة مربعة لمدة 30 دقيقة.

بعد أن يجف المقص ، قم بتقطيع أنابيب الطرد المركزي إلى حلقات يبلغ ارتفاعها من سبعة إلى ثمانية ملليمترات. الآن سحق أطباق بتري منخفضة الالتصاق أو غير المعالجة أو الميكروبيولوجية إلى قطع صغيرة باستخدام أداة تكسير مناسبة. قم بإذابة ما يقرب من جرام واحد من جزيئات البلاستيك في 10 مل من الكلوروفورم طوال الليل داخل غطاء الدخان.

تحقق من لزوجة المحلول البلاستيكي السائل للتأكد من أنه مناسب لسحب العينات. إذا كان المحلول رقيقا جدا ، أضف جراما إلى ثلاثة جرامات من جزيئات البلاستيك الإضافية. إذا أصبح سميكا جدا ، قم بتخفيفه بحوالي خمسة ملليلتر من الكلوروفورم.

ضع حلقة بلاستيكية من الأوتوكلاف في وسط طبق بتري مقاس 60 ملم. ثم ضع البلاستيك السائل داخل الحلقة لتشكيل مقبض بلاستيكي. دع الأطباق تجف مكشوفة في غطاء تدفق رقائقي لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات.

بعد التجفيف ، قم بتعريض الأطباق للأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. للبدء ، احصل على أطباق بتري المعدلة التي تحتوي على مقابض بلاستيكية. بعد يومين من حصاد الغضروف ، اغسل قطع الغضروف في محلول هانك باستخدام أطباق بتري 60 ملم.

ثم قم بتقطيع الغضروف إلى شظايا يبلغ قطرها حوالي ملليمتر إلى ملليمترين باستخدام مقص الأوتوكلاف. انقل قطع الغضروف إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وهضمها في محلول كولاجيناز من النوع الثاني بنسبة 0.01٪ في DMEM لمدة ثماني إلى 12 ساعة في حاضنة شاكر مدارية. بعد الهضم ، أضف شظايا الغضروف باستخدام DMEM وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 جم لمدة 10 دقائق.

بعد التخلص من محلول الغسيل ، أعد تعليق الأجزاء في وسط زراعة الخلايا الغضروفية وبذرها في قارورة لاصقة T25 مغلفة مسبقا بمحلول جيلاتين 0.1٪ واحتضنها. بعد ذلك ، قم بزراعة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات في ألواح من ستة آبار مغلفة مسبقا بمصفوفة تحتوي على بروتينات خارج الخلية. لبدء التمايز نحو النسب الغضروفية, زراعة iPSCs في وسط A لليومين الأولين.

في اليوم الثالث ، استبدل المتوسط A بمحلول يستبعد CHIR-99021 ومثبط rho-kinase مع الحفاظ على جميع المكونات الأخرى دون تغيير. في اليوم 10 ، انقل الخلايا الشبيهة بالخلايا الغضروفية إلى متوسط B المصمم لتسهيل تكوين الغضروف ، ثم قم بإذابة 1.5٪ أرجاروز في الميكروويف لمدة 60 إلى 90 ثانية عند 700 واط. بمجرد تسييلها ، أضف 75 ميكرولترا من الاغاروز إلى كل بئر من لوحة ثقافة معلق الخلايا المكونة من 96 بئرا واتركها تتماسك في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من DMEM إلى كل بئر واحتضن اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 12 ساعة على الأقل. في اليوم 12 ، لاحظ التغيرات الظاهرية المرتبطة بتكوين الذكورة للمضي قدما في بدء التكوين الكروي. افصل الخلايا عند التقاء 80٪ من اللوحة باستخدام محلول 0.05٪ تربسين.

بعد إضافة كميات متساوية من DMEM مع 10٪ FBS ، انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 200 جم لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من متوسط B ونقلها إلى قارورة زراعة خلية مساحتها 75 سم مربع مغلفة مسبقا بمحلول جيلاتين 0.1٪. بمجرد أن تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء كطبقة أحادية ، افصلها مرة أخرى باستخدام التربسين وأعد تعليقها في متوسط B ، والآن قم بتوزيع الخلايا في صفيحة 96 بئرا مغطاة ب 1.5٪ agarose بكثافة 100،000 خلية لكل بئر ، جنبا إلى جنب مع 150 ميكرولترا من متوسط B. احتضان الخلايا لمدة يوم واحد على الأقل وثلاثة أيام كحد أقصى حتى تتشكل الكرويات.

ثم انقل الكرويات من الآبار باستخدام طرف ماصة سعة مليلتر واحد بنهاية مشذبة إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا. دع الكرويات تستقر لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق وقم بإزالة المادة الطافية. الآن اغمر الكرات في محلول مصفوفة غشاء القاعدي المذاب حديثا وغير المخفف عند أربع درجات مئوية.

بعد 30 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 100 جم لمدة دقيقة واحدة لجمع الكرات الكروية. أخيرا ، انقل الكرويات إلى المفاعلات الحيوية الصغيرة المحضرة وأضف ستة ملليلتر من متوسط B. ضع المفاعل الحيوي الصغير داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون. بعد 19 يوما من التمايز ، عبرت 99٪ من الخلايا عن علامات غضروفية aggrecan ، والكولاجين من النوع الأول ، والكولاجين من النوع الثاني ، و SOX9.

تم تحديد الغلاف الغضروفي عالي الجودة على أنه تلك التي تحتوي على ما لا يقل عن 90 إلى 95٪ من التعبير عن علامات الجينات الغضروفية ، والتي تم تقييمها من خلال تحليل التعبير الجيني في اليوم 30 من التمايز. أظهرت الكرويات الناضجة تشكل متسقا ، حيث نمت إلى قطر نموذجي يتراوح من ملليمتر إلى ملليمترين بعد شهرين ، مع ظهور الكرويات الأكبر حجما مناطق مركزية بها تجاويف أو نخر.