Name: سير عمل سريع وبسيط للقياس الكمي لهياكل ذبابة الفاكهة الخارجية للبالغين (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: اكتشف بروتوكول تصوير عالي الدقة ومنخفض التكلفة لقياس عيوب نمو عين ذبابة الفاكهة البالغة. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة ديناميكيات الأس الهيدروجيني داخل الخلايا وتأثيرها على تقدم السرطان.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. جمع ذبابة الفاكهة البالغة وتثبيتها
<ol>
	<li>قم بإعداد صلبان ذبابة الفاكهة أو سلالات مختارة وضعها في قوارير تحتوي على طعام الذباب. احتضان القوارير عند درجة الحرارة المطلوبة (عادة 25 درجة مئوية) حتى يتطور الذباب ويحيط البالغون (~ 10-14 يوما عند 25 درجة مئوية).</li>
	<li>قم بتخدير الذباب ب CO2 وضعه على وسادة ثاني أكسيد الكربون2 .</li>
	<li>قم بفرز الذباب بالريشة وحدد الأفراد الذين لديهم النمط الظاهري المطلوب (على سبيل المثال ، الأجنحة المستقيمة). اصنع فارز ذبابة الريش عن طريق تقليم ريشة الإوزة لتناسب الطرف المدبب لماصة مصلية سعة 1 مل.</li>
	<li>قم بإعداد أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل مع 1 مل من 70٪ إيثانول. ضع الذباب المحدد في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وضعه على الثلج. قم بتخزين أنابيب الطرد المركزي الدقيقة عند 4 درجات مئوية طوال الليل (الشكل 2 أ). ملاحظة: لا تحافظ على الذباب في الإيثانول لأكثر من 24 ساعة. سيؤدي التخزين طويل الأمد للذباب في 70٪ من الإيثانول إلى فقدان صبغة العين والجسم.</li>
</ol>
2. تحضير العينة عن طريق تركيب النقطة
ملاحظة: ذبابة الفاكهة هي حشرات ناعمة الجسم تصبح هشة وتنهار عند تجفيفها بالهواء. لذلك، يتطلب هذا البروتوكول تصوير العينات في نفس اليوم الذي يتم تركيبها فيه. اعمل في مجموعات صغيرة من ~ 5 ذباب في وقت واحد لمنع فقدان العينة. زيادة عدد العينات في مجموعة بناء على الكفاءة. يمكن تجفيف العينات التي تتطلب مزيدا من الوقت قبل التصوير من خلال سلسلة تركيز متزايدة من سداسي ميثيل ديسيلازان (HMDS)14.
<ol>
	<li>قم بقص النقاط المثلثة الصغيرة (7.1 مم × 2.7 مم) من البطاقات الأرشيفية التي يبلغ وزنها 65 رطلا باستخدام لكمة نقطية متخصصة. قم بإعداد النقاط عن طريق ثني الطرف (أضيق 25٪) بزاوية 90 درجة باستخدام ملقط Dumont # 5 ذو الطرف الدقيق (الشكل 2 ب).</li>
	<li>باستخدام ملقط Dumont # 5 ذو الطرف الدقيق ، قم بإزالة الذباب من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (الخطوة 1.4). امسح الذباب برفق بأنسجة مختبر خالية من النسالة لإزالة الإيثانول الزائد. ضع كل ذبابة على جانبها الأيسر على بطاقة فهرسة تحت مجهر تشريح. ملاحظة: قم بإزالة الذباب من الأنبوب عن طريق التمسك بهيكل تشريحي ليس منطقة الاهتمام - عند تصوير الرأس ، نحتفظ بعينات من الجناح أو الساق. لا تمسك عينات من البطن ، حيث يتم استخدام هذا الهيكل للصق الذبابة على نقطة البطاقة.</li>
	<li>تحضير الغراء المخفي ، وضبط اتساقه على اللزوجة المطلوبة. امزج 1-2 قطرات من غراء الجلد مع 1-2 قطرات من الماء منزوع الأيونات (DI) ، واخلطها مع ماصة نقل على بطاقة فهرسة. التقط نقطة بطاقة معدة في الطرف العريض باستخدام ملقط ، وضع كمية صغيرة من الغراء المخفف على الطرف المنحني للنقطة عن طريق وضعها في مزيج الغراء والماء (الشكل 2 ج). ملاحظة: يجب أن يكون الغراء قابلا للدهن ولكن ليس سائلا.</li>
	<li>ضع الطرف المنحني للنقطة على الجانب الأمامي من البطن الأيمن حول أجزاء البطن 2-3 (الشكل 2 ج). قبل أن يجف الغراء ، قم بإجراء تعديلات طفيفة على الذبابة بحيث يكون المحور الأمامي الخلفي للذبابة عموديا على الطرف المنحني للنقطة.</li>
	<li>أدخل دبوس التثبيت رقم 3 في الطرف العريض لنقطة البطاقة (الشكل 2 د) وثبته في كتلة تثبيت الحشرات (الشكل 2 ه). قم بتسمية كل دبوس أو صف من المسامير بالنمط الجيني المقابل.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig02.jpg"> 
الشكل 2: تحضير العينة. (أ) ذبابة الفاكهة البالغة يتم فرز بناء على علامات النمط الظاهري ويتم جمعها في أنابيب طرد مركزي دقيقة مصنفة تحتوي على 70٪ من الإيثانول على الجليد. يتم تخزين الذباب عند 4 درجات مئوية طوال الليل. (ب) يتم تحضير نقاط البطاقة الورقية عن طريق ثني الطرف الضيق بزاوية 90 درجة من باقي البطاقة باستخدام زوج من الملقط # 5. (ج) يتم استرداد الذباب من الأنابيب والسماح له بالجفاف في الهواء لفترة وجيزة. يتم تطبيق إخفاء الغراء على الطرف الصغير المطوي لنقطة البطاقة المعدة ويتم لصقه على الذبابة البالغة في أجزاء البطن 2-3. (د) يتم تثبيت العينات ، مع ملصق تعريف ، على دبوس حشرات من الفولاذ المقاوم للصدأ # 3. (ه) يتم تخزين العينات المثبتة على لوحة عينة حتى تصبح جاهزة للحصول على الصور. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
3. اكتساب تصوير تكديس التركيز عالي الدقة
<ol>
	<li>احصل على صور عالية الدقة لعيون الذبابة باستخدام نظام تصوير تكديس التركيز البؤري المجمع والمخصص الذي تم تجميعه وتخصيصه.<ol>
		<li>التقط الصور الفوتوغرافية باستخدام هيكل كاميرا DSLR باستخدام عدسة تليفوتوغرافي مقاس 70-200 مم متصلة بهدف مجهر Apo 20x عبر محول عدسة مقاس 77 مم.</li>
		<li>تأكد من إضاءة العينة بفلاش من خلال موزع (الشكل 3).</li>
		<li>تحكم في تحديد موضع Z باستخدام وحدة تحكم Stackshot وسكة ماكرو.</li>
		<li>قم بتوصيل الكاميرا والفلاش والمرحلة الآلية بحامل ثلاثي القوائم من الألومنيوم المؤكسد شديد التحمل.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ضع كل عينة مثبتة على نقطة على محور مسرح عالمي مع توجيه الرأس بحيث تكون العين متجهة نحو العدسة. قم بإجراء تعديلات على وضع الرأس عن طريق تحريك الرأس برفق باستخدام الملقط. تنبيه: يمكن أن تؤدي التعديلات الكبيرة والسريعة إلى قطع الرأس عن طريق الخطأ.</li>
	<li>مع ربط الكاميرا بجهاز كمبيوتر محمول ، اضبط إعدادات الاكتساب في البرنامج. صور العينات بتكبير 20x باستخدام الإعدادات التالية: قوة الفلاش 1/32 وسرعة الغالق 1/200 وفتحة العدسة F2.8 وISO 400. تأكد من إيقاف تشغيل أي من ميزات التركيز البؤري التلقائي وتثبيت الصورة. ملاحظة: توازن هذه الإعدادات بين إضاءة الفلاش المثلى وسرعة الغالق وعمق المجال. ستحتاج إلى تعديلها للتكبيرات الأخرى و / أو مجموعات العدسات.</li>
	<li>قم بتعيين موقع حفظ مكدس الصور الناتج (10-50 صورة) في مجلد الملفات المطلوب. تأكد من سعة تخزين كافية للصور (~ 8.5 ميجابايت لكل صورة).</li>
	<li>اضبط إعدادات مكدس التركيز البؤري على وحدة التحكم Stackshot في وضع المسافة التلقائية .<ol>
		<li>اضبط حجم الخطوة على 5 ميكرومتر واحسب عدد الخطوات عن طريق تعيين موضعي البدء والإيقاف لمكدس التركيز البؤري.</li>
		<li>اعرض العينة في وضع LiveView ومع الكاميرا في وضع التصوير التلقائي لتحديد مواضع البدء والإيقاف.</li>
		<li>حرك السكة بحيث يكون أقرب جزء من العينة في بؤرة التركيز (تعيين موضع البدء ) ، ثم انتقل إلى حيث تكون أبعد ميزة محل الاهتمام في التركيز (تعيين موضع النهاية ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>أعد الكاميرا إلى وضع التصوير اليدوي وابدأ الحصول على الصورة من وحدة التحكم Stackshot. ملاحظة: يعتمد وقت الحصول على الصورة على حجم العينة. كلما زاد عمق المجال اللازم للعينات الكبيرة ، تم تضمين المزيد من الشرائح في مكدس الصور ، مما سيطيل وقت الاقتناء الإجمالي.</li>
	<li>افتح الملفات في برنامج تكديس التركيز المشار إليه. إنشاء صورة مكدسة بالنقر على مكدس | محاذاة وتكديس الكل (PMax).</li>
	<li>احفظ الصورة النهائية على القرص الصلب للكمبيوتر كملف .tif بالنقر فوق ملف | حفظ صورة الإخراج. ملاحظة: وفقا لدقة ملف الصورة المكدس وعدد العينات المصورة، قد تكون محركات الأقراص الصلبة الخارجية الكبيرة (1 تيرابايت) ضرورية للنسخ الاحتياطي للصور. في هذا البروتوكول ، يبلغ حجم الصور المكدسة حوالي 100 ميجابايت لكل منها قبل ضغطها.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig03.jpg"> 
الشكل 3: الحصول على الصور. (أ) جهاز تصوير بأجزاء تحمل علامة على النحو التالي: أ) جسم كاميرا DSLR؛ ب) عدسة تليفوتوغرافي. ج) هدف ومحول مجهر Apo 20x ؛ د) فلاش؛ ه) ناشرات العدسة والقبة ؛ و) وحدة تحكم Stackshot ، سكة حديد الماكرو ، والمرحلة الدوارة ؛ ز) المرحلة العالمية جيمبال ؛ ح) حامل ثلاثي القوائم. (ب) جهاز تصوير مع موزع ضوء في مكانه. (ج) لقطة مقربة للعينة المركبة في موضعها للتصوير. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
4. سير عمل تحليل فيجي لحساب منطقة العين البالغة
<ol>
	<li>لتحليل الصور ، احصل على برنامج FIJI15 من موقع الويب ImageJ.net.</li>
	<li>اختر صورا للتحليل حيث تكون العين متمركزة ومحاذاة مع إضاءة كافية والحد الأدنى من الضبابية المحيطية، مما يشير إلى المحاذاة المناسبة مع الكاميرا.</li>
	<li>معايرة مقياس الصورة.<ol>
		<li>قم بتنزيل صورة شريط المقياس للتكبير 20x الذي يرتبط ب 500 ميكرومتر. بالتناوب ، في وقت الحصول على الصورة ، قم بتصوير مسطرة باستخدام نفس الإعدادات. افتح الصورة في برنامج FIJI.</li>
		<li>قم بقياس طول شريط المقياس (الشكل 4 أ). استخدم أداة الخط المستقيم لتتبع الخط بالضبط. انقر فوق تحليل | قياس. مسافة البكسل هذه تعادل 500 ميكرومتر (الشكل 4 ب).</li>
		<li>احسب وحدات البكسل لكل ميكرون. استخدم هذا لتحويل قياسات البكسل إلى قياسات ميكرومتر.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>افتح ملف الصورة المكدسة في فيجي (الشكل 4C).</li>
	<li>حدد عدسة مكبرة من شريط الأدوات لتكبير منطقة التركيز. حاول ملء الشاشة بالعين وبشرة الرأس المحيطة مباشرة (الشكل 4 د).</li>
	<li>حدد أداة التحديد اليدوي من شريط الأدوات. حدد منطقة الشبكية بأكبر قدر ممكن ، باتباع ملامح الصف الخارجي من ommatidia (الشكل 4E). لإزالة جزء من التحديد، اضغط باستمرار على زر الخيار وحدد وحدات البكسل المراد إزالتها. للإضافة إلى التحديد، اضغط باستمرار على زري الخيار والتبديل وحدد وحدات البكسل المراد إضافتها.</li>
	<li>لحساب المساحة، حدد تحليل | قم بالقياس من القائمة العلوية (الشكل 4F). ستظهر نافذة جديدة تحتوي على معلمات المنطقة والمتوسط والحد الأدنى والحد الأقصى . انسخ هذه البيانات والصقها في جدول بيانات للتوثيق والتحويل من قياسات البكسل إلى الميكرومتر.</li>
	<li>إجراء التحليلات الإحصائية المناسبة.</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig04.jpg"> 
الشكل 4: تحليل الصور في فيجي. (أ) قياس الصورة الأصلية. قم بتنزيل صورة المعايرة وقم بقياس طول شريط 500 ميكرومتر. (ب) اضبط القياس باستخدام وظيفة ضبط المقياس . (ج) افتح الصورة المكدسة. (د) تكبير الصورة بحيث تكون العين في المنتصف وملء الشاشة تقريبا. (ه) استخدم أداة Freehand Select لتحديد العين عند الحد بين الصف الخارجي من ommatidia والبشرة المحيطة. (F) يتم حساب قياس المساحة داخل المنطقة المحددة بالنقر فوق تحليل | قياس | منطقة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>تصوير وتحليل عالي الدقة لعيوب ذبابة الفاكهة في العين

<ol><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the eukaryotes.</a> Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).</li>
<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li>
<li>Hodgson, J. A., Parvy, J. -P., Yu, Y., Vidal, M., Cordero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+models+of+invasive+tumorigenesis+for+in+vivo+studies+on+tumour%2Fperipheral+host+tssue+interactions+during+cancer+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval models of invasive tumorigenesis for in vivo studies on tumour/peripheral host tssue interactions during cancer cachexia.</a> Int J Mol Sci. 22 (15), 8317(2021).</li>
<li>Lam Wong, K. K., Verheyen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+in+cancer%3A+mechanistic+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming in cancer: mechanistic insights from Drosophila.</a> Dis Model Mech. 14 (7), dmm048934(2021).</li>
<li>Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+Drosophila+genetics+and+its+insight+into+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">A perspective on Drosophila genetics and its insight into human neurodegenerative disease.</a> Front Mol Biosci. 9, e1060796(2022).</li>
<li>Drummond-Barbosa, D., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reclaiming+Warburg%3A+using+developmental+biology+to+gain+insight+into+human+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reclaiming Warburg: using developmental biology to gain insight into human metabolic diseases.</a> Development. 147 (11), dev189340(2020).</li>
<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).</li>
<li>Johnson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexagonal+patterning+of+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hexagonal patterning of the Drosophila eye.</a> Dev Biol. 478, 173-182 (2021).</li>
<li>Weasner, B. P., Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+history+of+the+eye-antennal+disc+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The early history of the eye-antennal disc of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 221 (1), iyac041(2022).</li>
<li>Pichaud, F., Casares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+an+optical+dome%3A+The+size+and+shape+of+the+insect+compound+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Shaping an optical dome: The size and shape of the insect compound eye.</a> Semin Cell Dev Biol. 130, 37-44 (2022).</li>
<li>Oster, I. I., Crang, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+Drosophila+mutant+and+wild+type+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Microsc+Soc%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of Drosophila mutant and wild type eyes.</a> Trans Am Microsc Soc. 91 (4), 600-602 (1972).</li>
<li>Gibb, T. J., Oseto, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGibb%2C+TJ+%22Insect+collection+and+identification%3A+Techniques+for+the+field+and+laboratory%22">Insect collection and identification: Techniques for the field and laboratory</a>. , Academic Press. (2019).</li>
<li>Mertens, J., Roie, M. V., Merckx, J., Dekoninck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+low+cost+compact+cameras+with+focus+stacking+functionality+in+entomological+digitization+projects%5BTitle%5D)+AND+%22ZooKeys%22%5BJournal%5D)">The use of low cost compact cameras with focus stacking functionality in entomological digitization projects.</a> ZooKeys. 712, 141-154 (2017).</li>
<li>Brown, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+further+chemical+alternative+to+critical-point-drying+for+preparing+small+%28or+large%29+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+Times%22%5BJournal%5D)">A further chemical alternative to critical-point-drying for preparing small (or large) flies.</a> Fly Times. 11, 10(1993).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Method%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Method. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+H%2B+efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 4, e03270(2015).</li>
<li>White, K. A., Grillo-Hill, B. K., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+behaviors+mediated+by+dysregulated+pH+dynamics+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cancer cell behaviors mediated by dysregulated pH dynamics at a glance.</a> J Cell Sci. 130 (4), 663-669 (2017).</li>
<li>Peralta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Nhe2+overexpression+induces+autophagic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Nhe2 overexpression induces autophagic cell death.</a> Mol Biol Cell. 35 (7), br13(2024).</li>
<li>Munnik, C., Xaba, M. P., Malindisa, S. T., Russell, B. L., Sooklal, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+A+platform+for+anticancer+drug+discovery+and+personalized+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: A platform for anticancer drug discovery and personalized therapies.</a> Front Genet. 13, 949241(2022).</li>
<li>Nitta, Y., Sugie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+neurodegenerative+diseases+using+Drosophila+and+the+development+of+novel+approaches+for+their+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Studies of neurodegenerative diseases using Drosophila and the development of novel approaches for their analysis.</a> Fly. 16 (1), 275-298 (2022).</li>
<li>Pletcher, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+using+the+Drosophila+melanogaster+TRiP+RNAi+collection+to+identify+metabolic+enzymes+required+for+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screen using the Drosophila melanogaster TRiP RNAi collection to identify metabolic enzymes required for eye development.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 9 (7), 2061-2070 (2019).</li>
<li>Bangi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+personalized+platform+identifies+trametinib+plus+zoledronate+for+a+patient+with+KRAS-mutant+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">A personalized platform identifies trametinib plus zoledronate for a patient with KRAS-mutant metastatic colorectal cancer.</a> Sci Adv. 5 (5), eaav6528(2019).</li>
</ol>

ذبابة الفاكهة السوداء هو كائن حي نموذجي وراثي قوي تم استخدامه لعقود لتوضيح مسارات الإشارات الجزيئية والسلوكيات الخلوية. تم تحديد العديد من مسارات الإشارات المحفوظة تطوريا والتي تعتبر ضرورية للتطور متعدد الخلايا لأول مرة وتحديد آلية عملها في ذبابة الفاكهة. حوالي 65-75٪ من جميع الجينات المرتبطة بالأمراض البشرية لديها أخصائيي تقويم العظام في ذبابة الفاكهة1،2. ذبابة الفاكهة البالغة العين هي نموذج مهم سمح بفحوصات جينية غير متحيزة سهلت اكتشاف الجينات المحفوظة المهمة المتورطة في الأمراض البشرية ، بما في ذلك السرطان3،4 ، والتنكس العصبي5 ، واضطرابات التمثيل الغذائي6.
تتكون عين ذبابة الفاكهة من ~ 800 وحدة عيون ، تسمى ommatidia ، والتي يتم تنظيمها بدقة في نمط سداسي عبر سطح العين البالغة7. يتكون كل أوماتيدييوم من ثمانية خلايا عصبية مستقبلة للضوء تحتل موقعا مميزا داخل شبه منحرف غير متماثل. يتم دعمها بواسطة أربع خلايا مخروطية غير عصبية وخليتين صبغيتين أساسيتين تفرزان العدسة والمخروط الزائف لتركيز الضوء على المخططات المستشعرة للضوء للخلايا العصبية المستقبلة للضوء. يتم فصل ommatidia المجاورة بصف واحد من الخلايا الشبكية interommatidial ، والتي تتكون من خلايا صبغية ثانوية ، وخلايا صبغية ثلاثية ، ومجمعات شعيرات حسية ميكانيكية8،9،10.
تظهر الاضطرابات في نمو العين في عيون البالغين على شكل زيادة أو نقصان حجم العين ، أو وفرة أو بنية غير طبيعية للعدسات أو الشعيرات ، أو "العين الخشنة" حيث يتعطل الزخرفة السداسية الثابتة عادة بحيث لا يمكن متابعة صف من ommatidia عبر سطح العين. يمكن تسجيل هذه الأنماط الظاهرية على مستوى الأنسجة الإجمالية باستخدام مجاهر التشريح. يتضمن التحليل التفصيلي للأنماط الظاهرية تقليديا الفحص المجهري الإلكتروني المتبوعا بالتحليل الكمي للصور11. ومع ذلك ، فإن الفحص المجهري الإلكتروني المسح يتطلب أجهزة باهظة الثمن ، وكواشف مكلفة ، وإعداد عينات تمتد لأيام ، وغالبا ما يكون موظفا بدوام كامل للحفاظ عليه.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig01v2.jpg"> 
الشكل 1: سير العمل لتصوير هياكل ذبابة الفاكهة البالغة. (أ) جمع ذبابة الفاكهة البالغة وإصلاحها في 70٪ من الإيثانول. (ب) إعداد عينات للتصوير عن طريق التركيب النقطي وتثبيته على المسامير. (ج) الحصول على صور عالية الدقة من خلال تكديس التركيز البؤري والتكامل. (د) تحديد الصور كميا باستخدام الفيجي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تقدم هذه الورقة سير عمل غير مكلف نسبيا ، وله وقت قصير لإعداد العينة ، ويمكن إعداده بسهولة على مقعد مختبر بطول 3 أقدام ، ولا يتطلب مواد خطرة ، ويمكن أن يكون إضافة طويلة العمر لمختبرات أبحاث ذبابة الفاكهة (الشكل 1). التثبيت النقطي هو تقنية حشرية تستخدم لتجفيف الحشرات الصغيرة الرخوة في الهواء والحفاظ عليها ، مثل ذبابة الفاكهة12. تعتمد هذه الطريقة على الجمع بين أهداف المجهر وكاميرات DSLR عالية الدقة لتكبير فعال من 10x إلى 1,000x. يتم التغلب على العمق المحدود للمجال المتأصل في التصوير الفوتوغرافي عن طريق تكديس التركيز: تجميع سلسلة من الصور معا مع تحرك المستوى البؤري عبر العينة ذات الأهمية13. تنتج هذه الطريقة صورا عالية الدقة مناسبة لقياس الأنماط الظاهرية ويمكن تكييفها بسهولة مع الهياكل الأخرى ذات الأهمية ، مثل الجناح والساق والصدر والبطن. يستخدم سير عمل تحليل الصور برنامج تحليل الصور المجاني FIJI (NIH ImageJ). تجعل هذه المنهجية إعداد العينات والتصوير عالي الدقة والتحليل في متناول الطلاب الجامعيين والعلماء في المؤسسات التي تعاني من نقص الموارد.

<table><tbody><tr><td>1 مل ماصة مصلية</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>170353N</td><td></td></tr><tr><td>1.7 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة</td><td>Genesee Scientific &nbsp ؛</td><td>24-282LR</td><td></td></tr><tr><td>20x Apo المجهر الهدف</td><td>Mitutoyo Corp.</td><td>378-804-3</td><td></td></tr><tr><td>أرشيفية 65 رطل من البطاقات &nbsp;</td><td>شركة Neenah، Inc.</td><td>91901</td><td></td></tr><tr><td>Canon EF 70-200 mm USM II عدسة تليفوتوغرافي</td><td>Canon</td><td>3044C002</td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS 6D Mark II DSLR جسم الكاميرا</td><td>Canon</td><td>1897C002</td><td></td></tr><tr><td>Diffuser Dome</td><td>Solutions Macroscopic Solutions&nbsp;</td><td>PA-DIF-GIM-SM</td><td></td></tr><tr><td>الناشر ل Mitutoyo M Plan APO الأهداف</td><td>الحلول العيانية &nbsp;</td><td>mitutoyo-ناشرات</td><td></td></tr><tr><td>ذبابة الفاكهة قارورة والمقابس</td><td>Genesee العلمية&nbsp;</td><td>32-117BF</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 ملقط رفيع</td><td>الرأس فيشر ساينتفيك</td><td>NC9889584</td><td></td></tr><tr><td>ريش أوزة</td><td>أمازون</td><td>B01CMMJI6U</td><td></td></tr><tr><td>حامل ثلاثي القوائم من الألومنيوم المؤكسد للخدمة الشاقة</td><td>حقا Right Stuff، LLC</td><td>TFA-32G</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>مناديل مختبر خالية من النسالة</td></tr><tr><td>Levenhuk M1000 Plus كاميرا</td> <td>رقميةLevenhuk</td><td>70358</td><td></td></tr><tr><td>رقم 3 دبوس التركيب</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-3</td><td></td></tr><tr><td>Nutri-Fly Bloomington ذبابة الفاكهة media</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>66-113</td><td>يطير الغذاء</td></tr><tr><td>بوينت بانش</td><td>إم سي ميث للتصنيع ، Inc.</td><td>448 التفاصيل</td><td></td></tr><tr><td>Screwknob المشبك</td><td>حقا الأشياء الصحيحة ، LLC</td><td>SK-Clamp</td><td>لربط سكة الماكرو بوحدة التحكم ثلاثية</td></tr> القوائم <tr><td>Stackshot و Macro</td><td>Rail Cognisys Inc.</td><td>ST3X_100_BUNDLE</td><td></td></tr><tr><td>محول حلقة تنحي&nbsp;</td>محول <td>عدسة 763461174207 كاميرا سلاح الجو الملكي</td><td></td><td>البريطاني لتوصيل هدف المجهر بعدسة الكاميرا</td></tr><tr><td>Titebond Glue</td><td>Franklin International</td><td>5013</td><td></td></tr><tr><td>Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite Flash</td><td>Shenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co.</td><td>YN-24EX</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS Utility (الإصدار 3.16.1).&nbsp;</td><td>تم إصدار برنامج الاستحواذ</td> <td>Canon</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td>Fiji كمصدر مفتوح بموجب رخصة GNU العمومية العامة. فيجي الإصدار 2.14.0/1.54f&nbsp;</td></tr><tr>برنامج <td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad ، بوسطن ، ماساتشوستس الولايات المتحدة الأمريكية</td><td></td><td>الإصدار 10.3.1</td></tr><tr><td>Zerene Stacker (v.1.04)</td> <td>Zerene Systems، LLC</td><td></td><td>Focus Stacking</td></tr></tbody></table> Software

سير عمل سريع وبسيط للقياس الكمي لهياكل ذبابة الفاكهة الخارجية للبالغين

A Rapid, Simple Workflow for Quantification of External Adult Drosophila Structures

ذبابة الفاكهة العين هي نظام نموذجي ممتاز لدراسة زخرفة الأنسجة والتحكم في النمو وموت الخلايا. نشرنا مؤخرا دراسة تبحث في كيفية تأثير الأس الهيدروجيني داخل الخلايا (pHi) على نمو الأنسجة. أولا ، أنشأنا نظاما وراثيا حيث يتسبب الإفراط في التعبير عن مبادل البروتون الصوديوم DNhe2 (تقويم العظام للثدييات NHE1) في العين النامية في حدوث عيوب في الزخرفة وزيادة التكاثر16. لوحظ زيادة التكاثر مع ارتفاع درجة الحموضة عبر الأنواع من الخمائر إلى الثدييات17. ومع ذلك ، لاحظنا أيضا أنه مع زيادة درجة الحموضة ، بدت العين البالغة أصغر حجما مقارنة بالضوابط.
تم إجراء تحليل كمي لمنطقة العين البالغة لتحديد كيف يقلل تعبير DNhe2 المرتفع من حجم الأنسجة في ذبابة الفاكهة . حصلنا أولا على صور منخفضة الدقة باستخدام مجهر إدراج العين (الشكل 5 أ) ، لكنها كانت ذات جودة غير كافية لإجراء القياسات الكمية. على وجه التحديد ، لا يتم التركيز على حواف العين ، مما يمنع القياس الدقيق لمنطقة العين.
قمنا بقياس مساحة كل عين في صور عالية الدقة لعيون ذبابة الفاكهة البالغة (الشكل 5 ب). كان للذباب الذي يعبر عن GMR&gt;DNhe2 عيون أصغر بكثير (متوسط 74.28 ميكرومتر2) من التحكم في الخلفية الجينية مع1118 ذبابة (متوسط 125.83 ميكرومتر2) أو التحكم في السائق GMRGAL4 الذباب غير المتجانس (متوسط 142.49 ميكرومتر2) ، وهو انخفاض بنسبة 41٪ و 48٪ في المساحة ، على التوالي (الشكل 5 ج). يمكن أن يعزى هذا الانخفاض في حجم العين ، على الرغم من زيادة الانتشار ، إلى ارتفاع مستويات موت الخلايا.
تم استخدام جينات الالتهام الذاتي المعروفة ، بما في ذلك Atg1 ، التي تحفز تكوين البلعمة ، في دراسات التفاعل الجيني (الشكل 5). تم قياس التأثيرات على حجم العين البالغة باستخدام التصوير الفوتوغرافي عالي الدقة وتحليل المنطقة (الشكل 5 ب). تمت استعادة حجم العين (129.9 ميكرومتر2 مقابل 74.28 ميكرومتر2) في ذباب GMR&gt;DNhe2 متغاير الزيجوت ل Atg13 مقارنة ب GMR&gt;DNhe2 وحده وكان مشابها لعناصر التحكم (الشكل 5 ج). إلى جانب تحليل العلامات الجزيئية ، تدعم نتائجنا زيادة موت الخلايا الذاتية عند ارتفاع درجة الحموضة.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig05.jpg"> 
الشكل 5: إنقاذ انخفاض حجم الشبكية المرتبط بزيادة درجة الحموضة داخل الخلايا مع انخفاض الالتهام الذاتي. (أ) صور منخفضة الدقة لعيون ذبابة البالغين تم التقاطها بمجهر إدراج العين. (ب) صور عالية الدقة لعيون الذبابة البالغة تستخدم لقياس حجم العين للأنماط الجينية التالية: ث1118؛ GMRGAL4. GMR&gt;DNhe2; GMRGAL4. ATG13; GMR&gt;DNhe2; Atg13. (ج) كان متوسط أحجام عيون البالغين المقاسة: w1118 (125.83 μm2 ، N = 7) ؛ GMRGAL4 (142.49 ميكرومتر2 ، N = 9) ، و GMR&gt;DNhe2 (74.28 ميكرومتر2 ، N = 6) ، GMRGAL4 ؛ Atg13 (146.4 ميكرومتر2 ، N = 15) ؛ GMR&gt;DNhe2; Atg13 (129.9 ميكرومتر2 ، N = 19) ويشار إليه بإظهار القيم المتوسطة مع نطاقات الربيعية. تم تحديد الدلالة الإحصائية من خلال اختبارات t غير المزاوجة مع تصحيح ويلش. تم نشر البيانات في B و C سابقا18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig05large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يتم تعزيز استنتاجاتنا من خلال إعداد العينة والتصوير عالي الدقة والتحليل الموصوف هنا. سمحت هذه الطرق بوصف دقيق وكمي لحجم عيون ذبابة الفاكهة البالغة ذات الأنماط الجينية المختلفة. نواصل استخدام هذا النهج لتقييم التفاعلات الجينية الأخرى التي من شأنها توضيح آليات التحكم في النمو المعتمد على الأس الهيدروجيني.

The Drosophila compound eye is a precisely patterned tissue that has revealed molecular mechanisms and biological processes that drive morphogenesis. It ...

a-rapid-simple-workflow-for-quantification-external-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

تستخدم عضلات الطيران ذبابة الفاكهة كنظام نموذجي لتنمية العضلات وعلم وظائف الأعضاء. يصف هذا الفيديو عضلات الطيران للبالغين ويسلط الضوء على بروتوكول لتشريح عضلات الطيران غير المباشرة النامية المناسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي من الشرانق.

ذبابة الفاكهة تشريح عضلات الطيران غير المباشر للخادرة المتأخرة (IFM): طريقة لجمع الأنسجة عالية الإنتاجية

يتم الحفاظ على مورفولوجيا وحجم وموقع العضيات داخل الخلايا تطوريا ويبدو أنها تؤثر بشكل مباشر على وظيفتها. أصبح فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات هدفا مهما لعلم الأحياء الحديث. نوضح هنا كيف يمكن تسهيل هذه الدراسات من خلال تطبيق التقنيات الكمية.

لماذا الكمي المسائل: توصيف الظواهر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات عصبي عضلي مفرق

ذبابة الفاكهة الدماغ الكبار هو نظام القيم لدراسة الدوائر العصبية، وظائف الدماغ العليا، واضطرابات معقدة. وسيلة فعالة لتشريح أنسجة المخ كله من الرأس ذبابة صغيرة وتسهيل الدراسات القائمة على الدماغ. نحن هنا وصف، بروتوكول تشريح خطوة واحدة بسيطة من أدمغة البالغين مع التشكل الحفاظ عليها جيدا.

وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أدمغة

تم إنشاء اثنين من خوارزميات تحليل الصور، "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" و "ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics"، لتحديد تسعة الميزات المورفولوجية للذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي (NMJ) تلقائيا.

اثنين من الخوارزميات لإنتاجية عالية ومتعدد حدودي الكمي ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; عصبي عضلي مفرق الصرف

يقدم هذا العمل طريقة لقياس بسرعة وبدقة تحديد تصبغ البطن من ميلانوغاستر ذبابة الفاكهة باستخدام تحليل الصورة الرقمية. هذا الأسلوب يبسط الإجراءات بين اكتساب النمط الظاهري وتحليل البيانات ويشمل عينة تصاعد، والحصول على الصور، واستخراج قيمة بكسل، وقياس سمة.

قياس التصبغ البطن في<em&gt; ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر</em

هذا البروتوكول يركز على التحليل الكمي لتعقيد أربوريزيشن الجذعية العصبية (نداك) في المورفولوجية، التي يمكن استخدامها لإجراء دراسات ل morphogenesis الجذعية.

التحليل الكمي لتعقيد أربوريزاتيون الجذعية العصبية في المورفولوجية

يصف هذا البروتوكول في مقايسة في الجسم الحي من البلعوم تستخدم لتقييم وقياس قدرة الشباب والمسنين Drosophila الهيموسيات الميلانوغاستر على البكتيريا البلعمية.

تقييم القدرة Phagocytic العمر محددة من الكبار دروسوزيلا الهيموسيات الميلانوغاستر باستخدام في فيفو الفاتن الدمج

يتم تقديم بروتوكول يسمح بتصور Drosophila melanogaster سليمة في أي مرحلة من مراحل التطوير باستخدام التصوير المقطعي microcomputed.

التصوير الحيواني كله من الميلانوغاستر Drosophila باستخدام التصوير المقطعي microcomputed

ذبابة الفاكهة هو نظام العين أداة مفيدة لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة ، وخاصة الأمراض التنكسية العصبية البشرية. ومع ذلك ، يمكن أن يكون القياس الكمي اليدوي للأنماط الظاهرية للعين الخشنة منحازا وغير موثوق به. نصف هنا طريقة يتم من خلالها استخدام ilastik و Flynotyper لتحديد النمط الظاهري للعين بطريقة غير متحيزة.

القياس الكمي ذبابة الفاكهة الظلانية للأنماط الظاهرية للعين: نهج حسابي يدمج الأحجار المرنة و Flynotyper

التمدد التكراري التهجين في الموقع (EASI-FISH) هو تقنية قوية تجمع بين الفحص المجهري التوسعي والتهجين الموضعي الفلوري (FISH) للكشف عن التعبير عن جينات متعددة في الأنسجة السميكة. يحدد هذا البروتوكول التطورات الحديثة في الطريقة وتكييفها لتسمية ذبابة الفاكهة الجهاز العصبي المركزي السليم.

الكشف عن تعدد الإرسال للتعبير الجيني في دماغ ذبابة الفاكهة السليم باستخدام التألق التكراري بمساعدة التمدد في التهجين الموضعي

اكتشف بروتوكول تصوير عالي الدقة ومنخفض التكلفة لقياس عيوب نمو عين ذبابة الفاكهة البالغة. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة ديناميكيات الأس الهيدروجيني داخل الخلايا وتأثيرها على تقدم السرطان.

سير عمل سريع وبسيط للقياس الكمي لهياكل ذبابة الفاكهة الخارجية للبالغين

استكشف المزيد من الفيديوهات