سير عمل سريع وبسيط للقياس الكمي لهياكل ذبابة الفاكهة الخارجية للبالغين

يهتم مختبرنا بفهم كيفية تعديل ديناميكيات الأس الهيدروجيني داخل الخلايا للسلوكيات الخلوية. نحن مهتمون بالسلوكيات التي تساهم في تطور السرطان لأننا نعلم أن درجة الحموضة داخل الخلايا تزداد في معظم أنواع السرطان. نقوم بالكثير من الفحص المجهري ونطور بروتوكولات لتحديد البيانات من هذه الصور.

نحن نتعلم المزيد عن المسارات والعمليات الخلوية التي ينظمها الرقم الهيدروجيني. تحتوي معظم خطوط الخلايا السرطانية على درجة حموضة أعلى داخل الخلايا ويظهر العديد منها مستويات متزايدة من الالتهام الذاتي ، لكننا لم نكن نعرف أن هذا مرتبط. لقد أظهرنا مؤخرا أن ارتفاع درجة الحموضة داخل الخلايا في الخلايا الطبيعية وراثيا كاف لزيادة الالتهام الذاتي.

مختبرنا هو واحد من عدد قليل من المختبرات التي تدرس كيف ينظم الأس الهيدروجيني داخل الخلايا أو PHI سلوكيات الخلايا في نموذج حيواني كامل. لقد وجدنا أن زيادة PHI تعزز زيادة تكاثر الخلايا وهجرة الخلايا الغازية وعدم تنظيم الأنسجة. في الآونة الأخيرة ، وجدنا أن ارتفاع درجة الحموضة الصحية يعزز الالتهام الذاتي ، وهو شكل من أشكال أكل لحوم البشر الخلوي.

نحن نعالج الفجوة الناتجة عن التكلفة العالية والتعقيد لإعداد العينات للتسويق عبر محرك البحث ، مما يحد من إمكانية الوصول إليها للعديد من المختبرات. في ولاية سان خوسيه ، نفتقر إلى الموارد الخاصة بالتسويق عبر محرك البحث. لذلك قمنا بتطوير بروتوكول يسهل الوصول إليه وبأسعار معقولة يسمح لنا بالتقاط صور عالية الدقة دون الحاجة إلى معدات باهظة الثمن.

يجمع هذا البروتوكول بين التقنيات التقليدية المستخدمة في علم الحشرات ويوفر بديلا فعالا من حيث التكلفة وسهل الاستخدام للفحص المجهري الإلكتروني المسح. يمكن تكييفه بسهولة لالتقاط صور عالية الدقة لأجزاء مختلفة من الذبابة أو عينات مختلفة. للبدء ، حدد سلالة ذبابة الفاكهة المرغوبة وضعها في قارورة تحتوي على طعام الذباب.

احتضن القارورة على حرارة 25 درجة مئوية حتى ينمو الذباب ويقترب البالغون. بعد ذلك ، قم بتخدير الذباب البالغ بثاني أكسيد الكربون ووضعه على وسادة ثاني أكسيد الكربون. قم بإعداد فارز ذبابة الريش عن طريق تقليم ريشة الإوزة لتناسب الطرف المدبب لماصة مصلية سعة مليلتر واحد.

فرز الذباب بالريشة وحدد الأفراد ذوي الأجنحة المستقيمة. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من 70٪ من الإيثانول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 ملليلتر. انقل الذباب المحدد إلى الأنبوب وضع الأنبوب على الجليد.

باستخدام لكمة نقطة متخصصة. قطع نقاط مثلثة صغيرة من مخزون بطاقات الأرشيفية 65 رطلا. ثم استخدم ملقط دومون رقم خمسة لثني طرف كل نقطة بزاوية 90 درجة.

قم بإزالة الذباب من أنبوب الطرد المركزي الصغير باستخدام ملقط دومون رقم خمسة ذو الطرف الدقيق. امسح الذباب برفق بأنسجة خالية من النسالة لإزالة الإيثانول الزائد. ضع كل ذبابة على جانبها الأيسر على بطاقة فهرسة تحت مجهر تشريح.

باستخدام ماصة النقل ، امزج قطرة أو قطرتين من غراء الإخفاء مع قطرة أو قطرتين من الماء منزوع الأيونات على بطاقة فهرسة. التقط نقطة بطاقة معدة في الطرف العريض باستخدام ملقط وامسح الطرف المنحني في مزيج ماء الغراء لتطبيق كمية صغيرة من الغراء. ضع الطرف المنحني للبطاقة على الجانب الأمامي من البطن الأيمن للذبابة حول جزأين من البطن الثاني والثالث.

قبل أن يجف الغراء ، اضبط الذبابة بحيث يكون محورها الخلفي الأمامي عموديا على الطرف المنحني لنقطة البطاقة. أدخل دبوس التثبيت رقم ثلاثة في الطرف العريض لنقطة البطاقة ، وثبته في كتلة تثبيت الحشرات. قم بتسمية كل دبوس أو صف من المسامير بالنمط الجيني المقابل.

للحصول على صور عالية الدقة لعيون ذبابة الفاكهة المثبتة على النقطة ، قم بتشغيل نظام التصوير المكدس. ثم قم بإعداد هيكل كاميرا DSLR بعدسة تليفوتوغرافي من 70 إلى 200 ملم متصلة بهدف مجهر Apo 20x عبر محول عدسة 77 ملم. تأكد من إضاءة العينة بفلاش من خلال موزع.

تحكم في موضع الكاميرا Z باستخدام وحدة تحكم StackShot وسكة ماكرو. ضع الذبابة المثبتة على النقطة على محور المسرح العالمي مع توجيه العين للعدسة. اضبط موضع الرأس بعناية باستخدام الملقط للحصول على المحاذاة المثلى.

اربط الكاميرا بجهاز كمبيوتر محمول واضبط إعدادات الاكتساب. اضبط التكبير على 20x وسرعة الغالق و 1/200 من الثانية وفتحة العدسة f / 2.8 و ISO 400. بعد ذلك ، قم بتعيين موقع حفظ مكدس الصور الناتج في مجلد الملفات المطلوب.

الآن ، اضبط إعدادات مكدس التركيز البؤري على وحدة التحكم StackShot في وضع المسافة التلقائية. اضبط حجم الخطوة على خمسة ميكرومترات واحسب عدد الخطوات عن طريق تعيين مواضع البدء والإيقاف لمكدس التركيز البؤري. اعرض العينة في وضع العرض المباشر مع الكاميرا في وضع التصوير التلقائي.

حرك السكة بحيث يكون أقرب جزء من العينة في بؤرة التركيز. بعد ذلك ، انتقل إلى أبعد ميزة ذات أهمية واضبط التركيز. أعد الكاميرا إلى وضع التصوير اليدوي وابدأ الحصول على الصورة من وحدة التحكم StackShot.

بعد التصوير ، افتح ملفات الصور المكتسبة في برنامج تكديس التركيز المشار إليه. حدد Stack، ثم قم بمحاذاة الكل وتكديسه أو Pmax لإنشاء صورة مكدسة. ثم انقر فوق ملف واحفظ صورة الإخراج لحفظ الصورة المكدسة النهائية كملف tif

بعد تصوير عيون ذبابة الفاكهة المثبتة على الدبوس ، حدد الصورة المكدسة للتحليل حيث تتمركز العين ومحاذاة مع الإضاءة الكافية والحد الأدنى من الضبابية المحيطية. افتح صورة شريط مقياس 500 ميكرومتر في برنامج فيجي. قم بقياس طول شريط المقياس باستخدام أداة الخط المستقيم.

انقر فوق تحليل وقياس لتسجيل مسافة البكسل ، والتي تتوافق مع 500 ميكرومتر. بعد ذلك ، احسب وحدات البكسل لكل ميكرون واستخدمها لتحويل قياسات البكسل إلى قياسات ميكرومتر. افتح ملف الصورة المكدس في فيجي.

حدد عدسة مكبرة من شريط الأدوات لتكبير منطقة التركيز البؤري. املأ الشاشة بالعين وبشرة الرأس المحيطة. بعد ذلك ، من شريط الأدوات ، حدد أداة التحديد اليدوي وحدد منطقة الشبكية بعد الصف الخارجي من ommatidia.

لإزالة جزء من التحديد، اضغط باستمرار على زر الخيار وحدد وحدات البكسل المراد إزالتها. للإضافة إلى التحديد، اضغط باستمرار على زري الخيار والتبديل وحدد وحدات البكسل المراد إضافتها. لحساب المساحة، حدد تحليل وقياس.

ستعرض نافذة جديدة المساحة والمتوسط والحد الأدنى والأقصى للمعلمات. انسخ البيانات ولصقها في جدول بيانات للتوثيق والتحويل من قياسات البكسل إلى الميكرومتر. أدى الإفراط في التعبير عن DNhe2 في ذباب GMR-DNhe2 إلى عيون بالغة أصغر بكثير مقارنة بالذباب البالغ من النوع البري.

أظهر ذباب GMR-DNhe2 انخفاضا بنسبة 41٪ في مساحة العين مقارنة بالذباب البري وانخفاضا بنسبة 48٪ مقارنة بالذباب GMRGAL4 متغاير الزيجوت. تمت استعادة حجم العين في ذباب GMR-DNhe2 متغاير الزيجوت لأليل Atg1 3 ، مما جعله يصل إلى 129.9 ميكرومتر مربع من 74.28 ميكرومتر مربع.