أنظمة نماذج الأنسجة العضوية للتحقيق في تفاعلات المضيف والممرض في المختبر

تتكون الأغشية الحيوية للوحة الأسنان من مئات الكائنات الحية الدقيقة التي يمكن أن تؤدي إلى التهاب في ظهارة الفم ، مما يؤدي إلى أمراض مثل التهاب اللثة. نريد أن نفهم هذه التفاعلات بشكل أفضل ، باستخدام نماذج الأنسجة العضوية. توفر هذه الأنظمة منصات مفيدة لتقييم طرائق العلاج البديلة بطريقة مضبوطة.

لذا فإن تقدم تقنيات التسلسل في السنوات الأخيرة يغير مجال بيولوجيا العدوى. تسمح لنا هذه التقنيات بالتحقيق حقا في تفاعلات مسببات الأمراض المضيفة ، باستخدام تقنيات OMICs المتعددة من خلال تقييم التوقيعات المضيفة والميكروبية على المستوى البروتيني والنسخ والتمثيل الغذائي. سلط بحثنا الأخير الضوء على أهمية التفاعلات بين المملكة والميكروبات في الالتهابات المرتبطة بالأغشية الحيوية.

من خلال استخدام أنظمة النماذج في المختبر ، تمكنا من التحقيق في تفاعلات الأغشية الحيوية للمضيف ، واختبار العلاجات الجديدة المضادة للأغشية الحيوية ، وتحديد المجتمعات الميكروبية ، باستخدام تقنيات مبتكرة مثل ذاكرة الوصول العشوائي والتحليل الطيفي. ستهدف الدراسات المستقبلية ، باستخدام نماذج الأنسجة العضوية هذه ، إلى تحقيق توقيع متعدد OMIC وتنميط الكائنات الحية الدقيقة والأنسجة المضيفة والثقافة معا. نأمل في الكشف عن التفاعلات المعقدة بين المضيف وأنواع معينة من البكتيريا والفطريات في نماذج الأغشية الحيوية الخاصة بنا.

للبدء ، قم بإزالة السيقان المجمدة من الخرز المسامي الذي يحتوي على أنواع المكورات العقدية من 80 درجة مئوية. إحياء أنواع المكورات العقدية على صفائح قاعدة مثقب الدم في كولومبيا ، والتي تحتوي على 5٪ دم حصان معقم منزوع الضرب. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي ، انقل ثلاث إلى أربع مستعمرات من الطبق إلى 10 ملليلتر من وسط مرق الصويا التربتون. استزراع المرق على حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 16 إلى 18 ساعة. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 3 ، 000 جم لمدة خمس دقائق عند 20 درجة مئوية.

اغسل كريات الخلية ب 10 ملليلتر من PBS المعقم. أعد تعليق الكريات في 10 ملليلتر من PBS وتوحيد كل معلق من أنواع المكورات العقدية ، بشكل فردي ، باستخدام مقياس الطيف الضوئي المضبوطة على 550 نانومتر. بعد التوحيد القياسي ، قم بتخفيف كل تعليق للمكورات العقدية ، من واحد إلى 10 ، للوصول إلى تركيز واحد في 10 إلى قوة سبع خلايا لكل مليلتر في مزيج واحد لواحد من مرق تود هيويت ووسط معهد روزويل بارك التذكاري.

ماصة 500 ميكرولتر من معلقات الخلايا المخففة إلى صفيحة ميكروتيتر 24 بئر ، تحتوي على قرص هيدروكسيباتيت 13 ملم. احتضان المزرعة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح بتكوين الأغشية الحيوية. بطريقة مماثلة ، استزراع الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية على قاعدة مثقاب لاهوائية حساسة ، تحتوي على 5٪ دم حصان معقم منزوع الضرب.

قم بتوحيد كل كائن حي دقيق لاهوائي إلى امتصاص معين ، وقم بتخفيفه في مزيج فردي من مرق تود هيويت ووسط معهد روزويل بارك التذكاري. بعد نضوج الأغشية الحيوية للمكورات العقدية ، قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة والوسائط المستهلكة بعناية من الآبار. أضف 500 ميكرولتر من المعيار واحد في 10 إلى قوة سبع خلايا لكل مليلتر معلقات لأربعة كائنات دقيقة لاهوائية في كل بئر.

احتضان الأغشية الحيوية لمدة 24 ساعة في ظل ظروف لاهوائية عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة والوسائط المستهلكة من الآبار. أضف 500 ميكرولتر من مزيج معقم من مرق تود هيويت ووسط معهد روزويل بارك التذكاري.

استزراع الأغشية الحيوية في ظروف لاهوائية لمدة 24 ساعة. في اليوم السابع ، اغسل الأغشية الحيوية مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من PBS المعقم للزراعة المشتركة. للبدء ، قم بإخراج ونقل ظهارة الفم البشري أو أنسجة الوسائط HOE إلى خزانة أمان من الدرجة الثانية.

أضف ملليلترا واحدا من وسائط الصيانة المزودة بالأنسجة إلى كل بئر من صفيحة 12 بئر. باستخدام ملاقط معقمة ، قم بإزالة إدخالات البولي كربونات التي تحتوي على أنسجة HOE من مثقب المغذيات ، و 24 لوحة شحن بئر. انقل الأنسجة إلى طبق 12 جيدا المحضر.

احتضان نماذج الأنسجة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لتأقلمها مع الظروف المختبرية. وفي الوقت نفسه ، لإزالة الأغشية الحيوية من أقراص الهيدروكسيباتيت ، استخدم إبرة وملاقط قياس 19 لرفع الأقراص من قاع لوحة 24 بئر. انقل الأقراص إلى بيجو ، تحتوي على مليلتر واحد من DPBS المعقم.

صوتنة الأقراص عند 35 كيلو هرتز لمدة 10 دقائق في حمام مائي صوتنة. بعد التأقلم ، استخدم الملقط لإزالة إدخالات الأنسجة من لوحة 12 بئر. ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الأغشية الحيوية مباشرة على نماذج الأنسجة.

انقل الإدخالات إلى لوحة أخرى من 12 بئر تحتوي على ملليلتر واحد من وسائط الصيانة الجديدة. احتضان نماذج الأنسجة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لمعالجة الأنسجة ، قم بإعداد 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل RLT ، الذي يحتوي على 1٪ شعاع ميركابتو إيثانول في أنبوب دائري لولبي بسعة ملليلتر.

أضف ما يقرب من 100 ميكرولتر من الخرز الزجاجي المغسول بالحمض 0.5 ملم إلى الأنبوب. باستخدام الملقط ، قم بإزالة الحشوات التي تحتوي على الأنسجة من الوسائط وتخلص من أي تعليق ميكروبي متبقي من الملحق. أمسك الملحق مقلوبا على مستوى العين ، ثم استخدم إبرة قياس 19 لتقطيع الأنسجة والغشاء بعناية من أسفل الحشو.

انقل الأنسجة والغشاء إلى مخزن RLT المعد. قم بتجانس الأنسجة لمدة 30 ثانية باستخدام الخالط الخرز. استخرج الحمض النووي الريبي من المحللة الناتجة ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة لمجموعة استخراج الحمض النووي الريبي.

اجمع وسائط الأنسجة المستهلكة المتبقية لتحليلات البروتينات ، باستخدام منهجيات الإنتاجية المنخفضة والعالية. تم تنظيم التعبير الجيني للمؤشرات الحيوية الالتهابية في أنسجة HOE بشكل كبير بعد التعرض لسونيكات الأغشية الحيوية ، مقارنة بالتحكم غير المحفز. لوحظت أكبر تغييرات الطي ل CCL2 و CXCL1 و CSF3.

تم زيادة تعبير IL8 mRNA في أنسجة HOE بمقدار 8.67 أضعاف ، بعد التحفيز باستخدام سونيكات الأغشية الحيوية ، مقارنة بالأنسجة الخاضعة للرقابة. تم زيادة مستويات بروتين IL8 في الوسائط المستهلكة من 1.005 نانوغرام لكل مليلتر في الأنسجة الضابطة إلى 4.245 نانوغرام لكل مليلتر في الأنسجة المحفزة للغشاء الحيوي.