تقييم الجينات غير الطبيعية المرتبطة بالنمو للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم من خلال الجمع بين تقنية CRISPR / Cas9 مع عد الخلايا

نطاق البحث هو التسبب في سرطان الدم. نحن نهدف إلى تحديد الجينات الحاسمة لانتشار HSPC غير الطبيعي من خلال الجمع بين CRISPR / Cas9 وفحوصات CCK-8 ، مما يكشف عن أدوارها في تكوين الأورام وإمكاناتها كأهداف للأدوية.

يوفر تحرير الجينات المستند إلى CRISPR / Cas-9 نهجا بسيطا وفعالا لتحقيق الضربة القاضية للجينات في الخلايا حقيقية النواة. يتمثل التحدي التجريبي الحالي في زيادة كفاءة خروج المغلوب CRISPR / Cas-9.

يستخدم بروتوكولنا فئران Cas-9 لتزويد خلايا نخاع العظام بتعبير استشاري Cas-9 ، وبالتالي التوصيل الفيروسي ل SGIs إلى الخلايا ، وبالتالي تحسين الكفاءة التجريبية بشكل كبير.

[مقدم العرض] للبدء ، احصل على عظم الفخذ والساق من الفأر التجريبي القتل الرحيم. انقل عظم الفخذ والساق إلى غطاء التدفق الصفحي مباشرة بعد إزالته للحفاظ على العقم. باستخدام حقنة معقمة سعة مليلتر واحد ، اغسل تجويف نخاع العظم باستخدام PBS الذي يحتوي على 2٪ FBS لجمع خلايا نخاع العظم. قم بضرب خلايا نخاع العظم لأعلى ولأسفل 30 إلى 50 مرة لتفريقها في خلايا مفردة. انقل خليط الخلية إلى أنبوب سعة 50 مليلتر ودوامة لخلط جيدا. أضف 10 ميكرولترات من معلق الخلية إلى 40 ميكرولترا من محلول تحلل كريات الدم الحمراء ، وضعها على الجليد لمدة خمس دقائق لتحلل كريات الدم الحمراء. ثم أضف 50 ميكرولترا من محلول Trypan الأزرق. تخلط جيدا وتحسب الخلايا القابلة للحياة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 800 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية واستنشق المادة الطافية. ثم أعد تعليق الخلايا بتركيز واحد إلى اثنين في 10 إلى قوة ست خلايا لكل مليلتر في نخاع العظام ، وسط ما قبل التحفيز. وبذر 10 مل من التعليق في طبق طوله 10 سم. احتضن الطبق لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. لجمع الخلايا المحفزة مسبقا في اليوم التالي ، أضف خمسة إلى 10 ملليلتر من PBS تحتوي على 2٪ FBS واشطف اللوحة بقوة. انقل الخلايا إلى أنبوب جديد ، وأضف Trypan blue إلى الخلايا. عد الخلايا القابلة للحياة في الخليط. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 800 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في محلول التلوث المحضر حديثا بتركيز حوالي 10 إلى قوة ست خلايا لكل مليلتر. قم بزرع أربعة ملليلتر من المعلق في كل بئر من ستة آبار. أغلق اللوحة بالبارافيلم وقم بجهاز الطرد المركزي عند 1,500 جم لمدة 90 دقيقة عند 32 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الخلايا برفق باستخدام ماصة دون تغيير الوسط. احتضن الطبق لمدة أربع إلى ست ساعات. بالنسبة للتعداء الأول ، استنشق ما يقرب من ثلاثة ملليلتر من الوسط الطافي من كل بئر في أنبوب ، وأضف حجما متساويا من وسط التحفيز المسبق لنخاع العظم. إذا تم شفط الخلايا عن طريق الخطأ ، كرر خطوات الطرد المركزي وإعادة التعليق كما هو موضح سابقا. بالنسبة للتعداء الثانوي ، في اليوم التالي ، قم بإزالة ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من الوسط من كل بئر وأضف حجما متساويا من محلول مخزون الفيروسات القهقرية المذاب حديثا جنبا إلى جنب مع كميات مناسبة من hepas و polygreen. قم بالطرد المركزي للوحة عند 1,500 جم لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الخلايا برفق واستمر في الحضانة لمدة أربع إلى ست ساعات. الآن ، استبدل الوسيط كما هو موضح سابقا واحتضنه لمدة 24 ساعة. اغسل اللوحة باستخدام PBS التي تحتوي على 2٪ FBS واجمع الخلايا. قم بتصفية الخلايا من خلال غربال 70 ميكرومتر قبل عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام Trypan blue. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 800 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في DMEM التي تحتوي على 10٪ FBS والفئران إنترلوكين -3 وإنترلوكين -6 وعامل الخلايا الجذعية. جهاز الطرد المركزي حوالي 0.5 إلى 1 × 10 إلى قوة ست خلايا عند 800 جم لمدة خمس دقائق وتخلص من المادة الطافية. قم بتخزين حبيبات الخلية عند -80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الجيني. الآن ، أضف 1 × 10 إلى قوة أربع خلايا لكل بئر في صفيحة مكونة من 96 بئرا ، مما يجعل ستة آبار مكررة لكل مجموعة. ثم أضف 100 ميكرولتر من PBS المعقم إلى الآبار المحيطة واحتضنه حتى نقاط زمنية مختلفة من 0 و 24 و 48 و 72 ساعة. استنشق الوسط في كل نقطة زمنية ، وأضف 110 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على 1/10 من حجم محلول CCK-8 إلى الآبار. احتضن الخليط لمدة ساعة. أخيرا ، قم بقياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي الدقيق. زادت ضربة المغلوب Trp53 بشكل كبير من القدرة التكاثرية للفأر والخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية مقارنة بالضوابط في 24 و 48 و 72 ساعة كما تم قياسها بواسطة اختبار CCK-8. قدرت كفاءة تحرير Trp53 بنسبة 7.3٪ باستخدام تحليل TIDE. وكشف تسلسل الجيل التالي عن طفرات تحدث في مواضع مختلفة في الجين.