تقنيات المشبك الرقعة لتحليل الحويصلة الداخلية الفردية

المقصورات الداخلية الجزومية هي أصغر العضيات في الخلايا. تقنيات الفيزيولوجيا الكهربية التقليدية غير قادرة على قياس تغيرات الجهد والتيار بشكل مباشر. تتيح تقنية مشبك التصحيح الداخلي التسجيلات المباشرة ، مما يسمح لنا بالدراسة مسبقا في القنوات الأيونية.

التحدي التجريبي الرئيسي هو أنه ليست كل المركبات تعمل على تكبير الجسيمات الحالة بشكل فعال. من الصعب تحديد الخلايا المناسبة ، وحتى مع الجسيمات الحالة المثالية ، فإن تسجيل القناة الأيونية الناجح غير مضمون. قمنا بتطوير تقنية المشبك الرقعة الداخلية في تمكين التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية المباشرة من الأغشية الداخلية الجسدية.

سمح لنا هذا الاختراق بتوصيف القنوات الأيونية ، مثل TRPMLs و TPCs التي تكشف عن أدوارها في الدفاع عن مسببات الأمراض ، وتنكس الخلايا العصبية ، واضطرابات التمثيل الغذائي. تتيح طريقتنا تسجيلات القناة الأيونية الليزوزومية المباشرة ، والتغلب على قيود حجم مشبك التصحيح للخلية الكاملة ، وتحسين اختيار الحويصلة مع دمج التقنيات القائمة على التألق. للبدء ، قم بتثبيت الأنبوب الشعري في القطبي.

اضغط على زر السحب الأخضر على لوحة المفاتيح. قم بفك مقبض التثبيت وإزالة الماصات المسحوبة من القطبي. بعد ذلك، ضع الماصات المسحوبة في حامل Microforge.

افحص أطراف الماصة باستخدام عدسة موضوعية 35x، مدمجة مع عدسة 15x لتكبير إجمالي يبلغ 525x. استخدم المعالج الدقيق لتقريب ماصات التصحيح من الفتيل. اضبط قرص درجة الحرارة على 80.

بمجرد تشغيل السخان ، اضغط مع الاستمرار على مفتاح القدم لمدة ثانية إلى ثانيتين لتطبيق نبضة حرارية قصيرة. بعد التلميع، ضع الماصات المصقولة في صندوق محكم الغلق لمنع تلوث الغبار. أضف ملليلتر واحد من محلول الحمام إلى الغرفة.

قم بإزالة زلة الغطاء مع خلايا HKE 293 المعالجة من لوحة 24 البئر. انقل زلة الغطاء إلى غرفة المجهر. استخدم إبرة تعبئة بلاستيكية محلية الصنع لملء ماصة العزل بمحلول الماصة.

قم بتركيب الماصة المملوءة في الطرف الأمامي لإعداد مشبك التصحيح. تحت المجهر بموضوعية 40x وعدسة 10x، حرك ماصة العزل بالقرب من الجسيمات الداخلية أو الجسيمات الحالة المتضخمة بدرجة كافية. قم بخفض ماصة العزل باستخدام المعالج الدقيق حتى تلامس حافة غشاء البلازما.

حرك الماصة بسرعة لتمزيق قطعة صغيرة من الغشاء. باستخدام نفس الماصة ، اضغط على الخلية من الجانب الآخر للضغط على الجسيمات الداخلية / الجسيمات الحالة على بعد ميكرومتر تقريبا من الخلية. املأ ماصة رقعة مصقولة حديثا بمحلول الماصة المناسب.

قم بتركيب الماصة في الطرف الأمامي لمكبر الصوت. ضع ضغطا موجبا من 20 إلى 50 ملليبار على الماصة وحافظ عليها عن طريق قفل الصمام. بعد ذلك، حرك طرف الماصة إلى محلول الحمام وضعه في وسط مجال الرؤية.

استخدم نبضات التيار المتكرر لتحديد مقاومة الماصة ومقاومة مانع التسرب ومقاومة السلسلة. راقب حجم طرف الماصة وتشكيل مانع التسرب وإنشاء التكوين الداخلي للذكور الكامل. حرك الماصة بسرعة بالقرب من الجزء العلوي من الحويصلة المستهدفة.

لاحظ الحويصلة تتحرك أو تتدحرج بسبب تدفق السوائل من الماصة. اضبط جهد الإزاحة للماصة إلى صفر مللي فولت. حرر الضغط الإيجابي على الفور لسحب الحويصلة نحو الماصة ، لتشكيل جيجاسيل في غضون ثانية واحدة.

لتسجيل الحويصلة بأكملها، استخدم نبضة قصيرة عالية الجهد تتراوح من مللي ثانية إلى خمسة مللي ثانية لتعطيل الغشاء عند نقطة التلامس بين الماصة والعضية. اضبط الجهد من 500 إلى 1000 مللي فولت. لتسجيل التيار ، قم بإجراء تجارب مشبك الجهد الداخلي باستخدام مجموعة واسعة من الفولتية المدخلة لتقييم خصائص الغشاء.

أثناء تكوين الجيجاسيل ، انخفضت الاستجابة الحالية بسرعة ، مما يشير إلى الإنشاء الناجح للوضع المرفق بالليزوسوم. التطبيق المتكرر لجهد الإدخال المستمر المسجل التيارات عبر الغشاء الداخلي ، مما يدل على التيارات القاعدية والمنشطة بناهض والتسرب.