جهاز تمدد متساوي المحور للفحص المجهري الفلوري متحد البؤر للخلايا الحية عالية التكبير

ندرس كيفية استجابة الخلايا والتكيف مع المحفزات الميكانيكية في السياق الفسيولوجي والمرضي. لهذا ، نستخدم جهاز التمدد لتطبيق قوى خارجية ، وهي سلالة في هذه الحالة ، على الخلايا.

لقد وجدنا كيف تتفاعل الخلايا وأنسجة الخلايا مع محفزات ميكانيكية معينة وكيف تستجيب ميكانيكيا للإشارات البيولوجية الأخرى.

جهاز التمدد الخاص بنا متعدد الاستخدامات مقارنة بالآخرين لأنه يوفر إمكانية تمديد الخلايا المزروعة على جل بولي أكريلاميد بصلبة مختلفة أو لإجراء تجارب ضغط.

[راوي] للبدء ، ضع حلقات PMMA على ورقة بيضاء من ورق البدلاء. قم بالالتفاف بحذر حول حافة اللوحة المطلية ب PDMS باستخدام شفرة لضمان قطع نظيف على طول المحيط بالكامل. استخدم الملقط لرفع الغشاء من حافة واحدة ، ثم قشره برفق بالإبهام لفصل نصف الغشاء بالتساوي عن اللوحة. استخدم الأصابع لتوزيع 96٪ من الإيثانول بالتساوي حول السطح العلوي بالكامل لحلقة PMMA. قم بإزالة غشاء PDMS بعناية من اللوحة عن طريق رفعه من الحافة المرفوعة مسبقا. بعد ذلك ، ضعه بشكل متماثل على حلقة PMMA المغطاة بالإيثانول ، مع ضمان عدم وجود تجاعيد مع تجنب التمدد. بعد ذلك ، خذ حلقة PMMA فارغة أخرى وضعها فوق حلقة التثبيت. استخدم مشابك معدنية لإغلاقها معا ، مع وضع غشاء PDMS بين الحلقتين. ضع النصف السفلي من حلقة التمدد على دعامة التثبيت. ضع حلقة PDMS محصورة على حلقة التمدد وادفعها لأسفل بقوة حتى تستقر بالكامل ، مما يضمن وضع الحشية بشكل صحيح. ضع الأوزان النحاسية الدائرية فوق العينة. بعد ذلك ، ضع النصف العلوي من حلقة التمدد المعدنية في الأعلى ، مع محاذاة فتحات البراغي. أدخل جميع البراغي وشدها. قم بقص PDMS حول الحلقة برفق باستخدام شفرة. قم بتغطية المجموعة بطبق بتري لحماية الغشاء من الغبار. قم بإعداد مخفف واحد 250,000 من حبات الفلورسنت 0.2 ميكرومتر في PBS باستخدام التخفيف التسلسلي. ووضع قطرة من 10 إلى 30 ميكرولتر من محلول الخرزة في وسط PDMS. اتركه يجف عند درجة حرارة لا تزيد عن 40 درجة مئوية لتجنب المشكلات المربكة بعد العلاج. الآن ، قم بتركيب جهاز التمدد على حامل مرحلة المجهر وقم بتأمين عمود التمدد على المجهر. ضع مادة التشحيم بسخاء على المنطقة الدائرية من المنشور. قم بتركيب حلقة التمدد المعدة على عمود التمدد وقم بربط الغطاء العلوي لإغلاق التجميع. بعد ذلك ، قم بتوصيل الجزء الخلفي من صندوق التحكم في الفراغ بمصدر التفريغ ، متبوعا بالجزء الأمامي من الصندوق بعمود التمدد. لإجراء معايرة الإجهاد ، اختر مجال اهتمام يحتوي على كثافة حبة عالية وكتل حبة يمكن التعرف عليها للمستخدم. احصل على صورة في حالة راحة مجال الرؤية المحدد واحفظ الموضع. ضع التمدد عند مستوى فراغ منخفض سالب 20 مللي بار ، مما يتسبب في الحركة في جميع الاتجاهات. الآن ، أعد التركيز البؤري في المستوى Z وحرك المرحلة في اتجاهات XY لتحديد نفس المنطقة ذات الاهتمام والحصول على صورة في الحالة الممتدة. ثم حرر السلالة وكرر الخطوات بمستوى فراغ أعلى. قم بتخزين الصور المكتسبة في مجلد منظم حسب العينة. الاسم ، صورة الخرزة المرجعية التي تم الحصول عليها دون تمدد reference_str1 وتمتد الصور عند مستويات فراغ متزايدة مثل stretched_str1 و stretched_str2 و stretched_str3 وما إلى ذلك. لتحديد السلالة ، افتح MATLAB وقم بتحميل رمز إجهاد الجل. بعد تعيين المعلمات، حدد الأصل، بالإضافة إلى مسارات مجلد التجربة وقم بتشغيل التعليمات البرمجية. بعد ذلك ، افتح stretched_str1 كما هو مطلوب في الكود ، متبوعا ب reference_str1. الآن ، احسب مصفوفة الإجهاد المتوسطة لكل مستوى فراغ. بعد تكرار هذه العملية لثلاث عينات على الأقل ، ارسم مصفوفة الإجهاد الوسيط مقابل مستوى الفراغ للحصول على منحنى المعايرة. لتغليف حلقة PDMS ، قم بتعقيمها تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. تحت خزانة السلامة الحيوية ، اشطف اللوحة الموجودة أسفل غطاء المحرك باستخدام PBS معقم. بعد شفط جميع PBS المستخدمة لشطف اللوحة. قم بإيداع قطرة من 100 إلى 200 ميكرولتر من المحلول في وسط الحلقة. ارسم محيط القطرة بعلامة دائمة من الجانب السفلي لغشاء PDMS واحتضانها. في يوم التجربة ، اغسل بروتين الالتصاق باستخدام PBS. بعد محاولة الخلايا ، انتقل إلى عد الخلايا. زرع عدد مناسب من الخلايا بحجم صغير من حوالي 20 إلى 50 ميكرولتر باستخدام وسائط خلية قياسية لتعزيز التعلق واحتضانها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون مع التحكم في الرطوبة. بعد 20 إلى 30 دقيقة ، أضف برفق 500 ميكرولتر من الوسائط فوق الخلايا وأعد اللوحة إلى الحاضنة للسماح بمزيد من انتشار الخلية. للحصول على دورة تحرير واحدة للتمدد والتصوير ، قم بتركيب حلقة التمدد على مرحلة المجهر كما هو موضح سابقا. بعد تحديد موقع الخلية ذات الأهمية ، سجل موضعها والتقط صورة للخلية الممتدة مسبقا. قم بتطبيق مستوى الفراغ المطلوب المقابل لإجهاد الركيزة المطلوب بناء على منحنى المعايرة لتمديد الخلية. لتحديد موقع خلية التمدد، أعد التركيز البؤري أولا في المستوى Z. ثم انتقل في اتجاهات XY لتوسيط الخلية في مجال الرؤية. سجل الصور خلال المدة المطلوبة. انتقل إلى الموضع الأصلي للخلية وقم بتنشيط وضع اكتساب المجهر للتأكد من أن التقاط الصور يبدأ فور إعادة التركيز البؤري. حرر التمدد وأعد التركيز البؤري بسرعة يدويا في المستوى Z. التقط صورا للخلية التي تم إصدارها للوقت المطلوب، مع ضبط التركيز يدويا طوال عملية الاستحواذ. للمعالجة اللاحقة ، افتح فيجي وقم بتحميل الصور المكتسبة في حالة الراحة وأثناء الإجهاد. استخدم مطابقة قالب المكون الإضافي في فيجي لتحديد منطقة من الخلية للمحاذاة. ضمنت المعايرة قابلية التكاثر والتحكم في الإجهاد المطبق ، مما يؤكد وجود علاقة خطية تقريبا بين الفراغ والإجهاد بنسبة تصل إلى 20٪. أظهر تحليل الإزاحة الشعاعية الخواص وتجانس الإجهاد فوق غشاء PDMS. كشف التصوير الفلوري لخلايا الخلايا الليفية تحت تمدد الخلايا الحية عن غزوات غشائية عند إطلاق التمدد ، والتي أعيد امتصاصها في غضون ثلاث إلى خمس دقائق. مكنت إعادة تمديد الخلايا الثابتة من التصوير في حالة ممتدة ، مما منع القطع الأثرية الاصطناعية القابلة للطي. سهل غشاء PDMS مع شبكة منقوشة التصوير متعدد الوسائط ، مما يسمح بتوطين نفس الخلايا في التألق والفحص المجهري الإلكتروني الماسح. شكلت الخلايا الموضوعة على المواد الهلامية الناعمة PAA المطلية بالفيبرونيكتين التصاقات بؤرية فقط عند خضوعها لدورات تمدد دورية محددة مقارنة بالخلايا غير الممتدة.