التقاط فواصل الموقع الهشة الشائعة بواسطة γH2A الأصلي. X تشيب

تركز رفاهيتنا على فقدان المواعدة ، ودور عدم استقرار الموقع الهش الشائع في جيفي في إعادة تكوين الورم. حاول تحديد التحركات الفيروسية في الخلايا السرطانية الجيروسكوجينية التي يمكن استغلالها علاجيا. بخلاف ذلك ، يوفر التصوير وتقنيات التسلسل ، مثل التعاطف مع الخلية المفردة وتصوير الخلايا الحية خرائطا عالية الدقة لعدم الاستقرار الجيني في الكتلة.

المنطقة في الجسم الحي بما في ذلك الضوضاء ونماذج الفئران المعدلة وراثيا وأنظمة أساس كريسبر من حولنا للتحقيق في آليات عدم الاستقرار الجيني للجينات الورمية بالتفصيل. ينصب اهتمام مختبرنا على المدى الطويل في تحديد نقاط الضعف المحددة في الخلايا السرطانية التي يمكن علاجها بشكل استراتيجي للعلاجات المصابة مع التركيز على تقليل الضرر الذي يلحق بالخلايا الطبيعية. يتضمن ذلك استكشاف نقاط الضعف الجينية والجينية للكشف عن الفرص العلاجية الطبيعية.

للبدء ، عالج خلايا HEK 293 T ب DMSO إيثيل ديكولين وهيدروكسي يوريا في ثلاثة أطباق مختلفة لمدة 24 ساعة. بعد غسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ، قم بالطرد المركزي لها عند 500 جرام أربع وخمس دقائق عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن البارد الطازج A ، واحتضنه على الثلج لمدة خمس إلى 10 دقائق.

راقب تقدم التحلل تحت المجهر الضوئي لتأكيد تحلل الخلية الكامل. بمجرد تحللها ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وأعد تعليق حبيبات النوى في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد A.جهاز الطرد المركزي مرة أخرى ، وأعد تعليق النوى السليمة ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنوكلياز الميكروكوكي عن طريق سحب العينات من خمس إلى 10 مرات. أضف على الفور الكمية المحددة مسبقا من نوكلياز المكورات الدقيقة إلى العينات.

ضع الأنابيب على محور دوار لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. أعد الأنابيب على الفور إلى الثلج ، وأضف EDTA لإنهاء عملية الهضم. بعد الدوامة ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت B والماصة لأعلى ولأسفل للخلط.

احتضن الأنبوب على الثلج لمدة خمس دقائق لإذابة البروتينات. لتكوير المادة غير القابلة للذوبان ، قم بالطرد المركزي للعينات بأقصى سرعة لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية الشفافة إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 ملليلتر ، تسمى جزء الكروماتين الأصلي.

للتحقق من تجزئة الكروماتين ، قم بإضافة 10 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. امزج المادة الطافية مع 20 ميكرولتر من الماء المقطر و 30 ميكرولتر من كحول الفينول كلوروفورم إيزوميل. بعد دوامة قوية ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 20،000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ولاحظ ثلاث طبقات متميزة: طبقة علوية شفافة ، وطبقة وسطى بيضاء ، وطبقة سفلية صفراء.

انقل بعناية 20 ميكرولتر من المرحلة المائية العلوية ، التي تحتوي على الحمض النووي إلى أنبوب جديد. افصل الحمض النووي المنقى في جل أغاروز 1.5٪ لمدة 30 دقيقة عند 100 فولت. تصور أنماط الهضم ، مع التأكد من أن حجم شظايا الكروماتين يتراوح بشكل أساسي بين 200 و 1000 زوج أساسي.

انقل 20 ميكرولتر من الكروماتين المهضوم إلى كل أنبوب ، يحتوي على 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف. قم بتسمية الأنابيب كعينات إدخال ، وقم بتخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. أضف 400 ميكرولتر من الكروماتين المهضوم إلى أنبوب آخر سعة 1.5 ملليلتر للترسيب المناعي للكروماتين أو الرقاقة.

انقل الجسم المضاد جاما H2 AX إلى عينة معالجة ب DMSO ، ومعالجة إيثيل ديكولين ، وعينة معالجة بالهيدروكسي يوريا. ضع الأنابيب على محور دوار على أربع درجات مئوية لمدة خمس ساعات ، أو يفضل طوال الليل. وفي الوقت نفسه ، باستخدام أطراف فتحة عريضة ، قم بإضافة 100 ميكرولتر من حبات البروتين المغناطيسي AG في أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر.

ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة ، ثم تخلص من السائل بعناية. بعد ذلك ، أعد تعليق الخرزات في مليلتر واحد من PBS يحتوي على 0.5٪ BSA. قم بتدوير الأنبوب على أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات.

ضع الأنبوب مرة أخرى على الحامل المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة وتخلص من المادة الطافية. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق الخرزات المشفرة مسبقا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت B. أضف 25 ميكرولتر من تعليق الخرزة المغناطيسية المشفر مسبقا إلى كل أنبوب عينة رقاقة. قم بتدوير الأنابيب على درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة ساعتين ، ثم ضع أنابيب الرقاقة على حامل مغناطيسي وانتظر حتى تلتصق الخرزات بجانب الأنبوب ويصبح المحلول واضحا.

تخلص من المادة الطافية الشفافة دون إزعاج الخرز المغناطيسي. أعد تعليق الخرزات في مليلتر واحد من مخزن الغسيل وقم بتدويرها عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ضع الأنابيب مرة أخرى على الحامل المغناطيسي وانتظر حتى يصبح المحلول واضحا قبل التخلص من المخزن المؤقت للغسيل.

بعد الغسيل النهائي ، قم بالطرد المركزي للأنابيب لفترة وجيزة عند 400 جم لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية لإزالة السائل المتبقي. ضع الأنابيب مرة أخرى على الحامل المغناطيسي وقم بإزالة أي سائل متبقي بعناية من قاع الأنبوب. بعد التحقق من كفاءة سحب الجسم المضاد للرقاقة ، باستخدام اللطخة الغربية ، أضف 50 ميكرولتر من مخزن الشطف إلى كل من عينات الرقائق المتبقية.

ضع الأنابيب على خلاط Therma ورجها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة واجمع الأنبوب في أنابيب جديدة. أضف 100 ميكرولتر من مخزن شطف الشطف إلى كل عينة شطف رقاقة ، و 180 ميكرولتر من مخزن الشطف المؤقت لكل عينة إدخال.

ثم أضف 200 ميكرولتر من كحول الفينول كلوروفورم الأيزواميل إلى كل عينة وقم بدوامة الأنابيب بقوة لخلطها. بعد طرد العينات بالطرد المركزي ، انقل الطبقة المائية العليا بعناية إلى الأنابيب التي تحتوي على 19 ميكرولتر من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية واثنين من ميكرولتر من محلول الجليكوجين. امزج عن طريق دوامة الأنابيب.

أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى كل عينة ، وقم بالدوامة جيدا. ضع الأنابيب على درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعتين ، أو طوال الليل لترسيب الحمض النووي. ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب قبل التخلص من المادة الطافية ، وإعادة تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من 70٪ إيثانول.

بمجرد إزالة الإيثانول المتبقي عن طريق الطرد المركزي ، جفف كريات الحمض النووي في الهواء لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق قبل إعادة تعليقها في 400 ميكرولتر من مخزن TE. أدت التركيزات العالية من نوكلياز المكورات الدقيقة إلى هضم الكروماتين على نطاق أوسع ، مما أدى إلى غلبة شظايا أحادية النوكليوسوم. في المقابل ، في تركيزات نوكلياز المكورات الدقيقة المنخفضة ، كانت غالبية شظايا الكروماتين أكبر ، وغالبا ما تتجاوز قاعدة كيلوغرام واحد.

تم ارتفاع مستويات Gamma H2 AX بشكل ملحوظ في الخلايا المجهدة بالتكرار ، والتي تمت معالجتها بإيثيل ديكولين ، مقارنة بالضوابط المعالجة ب DMSO كما هو موضح في عينات الإدخال لكل من الرقاقة الأصلية والرقاقة المتشابكة.