الرسم الميكانيكي للكرويدات باستخدام مطيافية بريلوين

نستخدم مطيافية بريلوين لتقييم ميكانيكا الخلايا بشكل غير جراحي لفهم دور علم الأحياء الميكانيكي في تقدم الأمراض. تسمح لنا التقنيات غير الجراحية، مثل مطيافية بريلوين، بتوصيف الميكانيكا بثلاثة أبعاد، ولكن دون إزعاج العينة. للبدء، قم بمعالجة آبار صفيحة البئر الدقيق مسبقا بإضافة 500 ميكرولتر من محلول الشطف المضاد للالتصاق إلى كل بئر.

قم بعمل الطرد المركزي على الطبق بدرجة حرارة 1,300 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة فقاعات الهواء، قم بإزالة محلول الشطف المضاد للالتصاق من الآبار. بعد ذلك، أضف ملليتر واحد من PBS إلى كل بئر واشطمه بالكامل.

بعد تكرار غسل PBS، حدد عدد الخلايا لكل كروي وعدد الكرويدات لكل جل وفقا للتصميم التجريبي. قم بإزالة الخلايا وأعد تعليقها في ملليلتر واحد من DMEM المكمل. ثم أضف ملليتر واحد من تعليق الخلية هذا في أحد بئر لوحة الميكروويل وامزج جيدا.

قم بعمل طرد مركزي على الطبق على حرارة 100 جرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. راقب لوحة البئر الدقيقة تحت المجهر للتأكد من توزيع الخلايا بشكل متساو وأنها استقرت في قاع الآبار. حضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة للسماح بتكوين الكروي.

لجمع الكرويدات، إزالة وسائل الثقافة بلطف وببطء دون إزعاج الكرويات. اقطع طرف الماصة المطلي ب PBS/FBS لتوسيع الفتحة وأضف 500 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر لإزالة الكرويدات. اجمع PBS الذي يحتوي على الكرويدات في أنبوب.

ثم نقل 50 ميكرولتر من نظام التعليق الكروي إلى بئر واحد من صفيحة بسعة 96 بئرا. للمساعدة في العد، ارسم صليبا على قاع البئر باستخدام علامة دائمة وعد عدد الكرويدات في هذا الحجم تحت المجهر. استخدم المعادلة لحساب العدد الكلي للكرويدات.

افتح برنامج SpectraLok وانتظر حتى يتم اكتشاف جميع الأجهزة المتصلة. ثم اختر كاميرا الطيف الطيفي. ثبت مكعب الأكريليك على حامل عينات المجهر بحيث يكون الجانب الشفاف مواجها للعدسة الموضوعية.

خفض العدسة الموضوعية قدر الإمكان وضع المكعب في المنتصف تحتها. تأكد من ضبط المسار البصري في المجهر بحيث يتم تعريض كاميرا الطيف عن طريق تدوير محدد المنفذ الدوار L.In نافذة كاميرا SpectraLok، وضبط وقت التعريض للحساس إلى 500 مللي ثانية وكسب البرمجيات إلى 100. اضغط على زر الالتقاط، وحرك العدسة الموضوعية ببطء إلى الأعلى.

استمر في رفع العدسة حتى تصبح قمم بريلوين مرئية وتستقر شدتها، مما يشير إلى أن النقطة البؤرية تقع داخل مكعب الأكريليك. الآن، افتح نافذة تحكم Pump Killer أو PK. قم بتكبير واحدة من ألمع أوامر بريلوين وضبط موقع مشغل الضغط بزيادات 100 ميكرومتر عن طريق الضغط على زر move rel لتقليل شدة ذروة رايلي.

إذا زادت إشارة رايلي، اضغط على العكس لتغيير اتجاه التعديل. بمجرد أن تنخفض شدة ذروة رايلي، قم بضبط ضغط الإيتالون بدقة على زيادات أصغر تبلغ 10 ميكرومتر. في نافذة الكاميرا، قم بالتكبير على أحد أوامر بريلوين.

اضغط S لرؤية الخطوط التي يطبق عليها LUT على صورة الكاميرا. افتح نافذة الإعدادات، واضغط على المعايرة السريعة لإعادة حساب الإزاحة الأفقية المثلى للخطوط تلقائيا. بعد التحقق من محاذاة الخطوط، قم بضبط محاور عدسة المتصل لتعظيم كفاءة الاقتران للضوء من قاتل المضخة إلى مقياس المطياف.

ثم افتح نافذة Spectrum واضغط على فك التغليف لاسترجاع الطيف. في مكعب أكريليك متجانس، استهدف قمع إشارة رايلي بالكامل وضبط حتى تصبح إشارة بريلوين واضحة للعيان. لحفظ المعلمات المحسنة، انقر على تحديث الكل، ثم احفظ الجميع في نافذة تحكم PK.

وأخيرا، في النافذة الرئيسية، اضغط على الحفظ في قسم إدخال/إخراج الملفات لتخزين الإعدادات. بعد فتح برنامج المسح، قم بتركيب طبق بتري ذو القاع الزجاجي الذي يحتوي على عينة الهيدروجيل الكروي بدلا من مكعب الأكريليك. أزل غطاء طبق بيتري، أضف كمية كافية من الوسائط لغمر الجل، وضع غطاء فوق الغلاف لمنع حركة الهلام.

حدد موقع الكروي عن طريق حجب شعاع الليزر أولا. حول مسار المجهر البصري إلى العدسة وشغل إضاءة الضوء الأبيض. باستخدام عصا التحكم، تحكم يدويا في مرحلة العينة لتحديد وتركيز الكرويد عليه.

احصل على صورة ساطعة للكروي وضبط سطوع الإضاءة عن طريق تدوير عجلة التحكم. قم بتحويل المسار البصري إلى R لتعريض كاميرا المجهر وضبط وقت التعريض حسب الحاجة. بعد ذلك، قم بضبط منفذ المجهر على L والتقط الخلفية مع الليزر لا يزال محجوبا.

قم بفك الليزر، وبناء على نسبة الإشارة إلى الضوضاء المطلوبة، اختر وقت تعريض بين 200 و500 مللي ثانية. من الطيف غير المغلف، اختر نطاق ملاءمة بريلوين القصوى. اضبط قيمة العتبة إلى حوالي نصف شدة ذروة بريلوين، واستبعد أي قمم بريلوين ذات سعة أقل من العتبة.

تطبيق تصحيح الطول الموجي على الليزر وفقا لجميع أزواج ذروات بريلوين المحددة. وأخيرا، اختر هندسة المسح النقطي عن طريق ضبط عرض المسح وحجم الخطوة، وابدأ المسح لتسجيل القياسات. أظهرت الصور الممثلة لكروي الخلايا الجذعية الميزنشيمية المدمج في الهيدروجيل خرائط مميزة لانحراف بريلوين وخرائط عرض خط بريلوين إلى جانب صور فلورية من الحقول المضيئة، والنوى، وخيوط الأكتين المقابلة.

تم تقسيم خريطة انحراف تردد بريلوين منخفضة الدقة إلى مناطق هلامية وكروية بناء على الشكل التفصيلي الذي تم تتبعه يدويا من صورة الحقل المضيء. تم استبعاد البكسلات الغامضة الناتجة عن أخذ العينات التنازلية من التحليل، بينما تم إنشاء أقنعة ثنائية واضحة لمناطق الهلام والكروي لاستخراج قيم BFS. أظهرت مقارنة خرائط BFS عالية الدقة ومنخفضة الدقة أن أخذ عينات النواة قدم قيم متوسطة BFS مماثلة للمسح عالي الدقة، مما يشير إلى قياس متسق لميكانيكا كتلة الكروي.

سيوفر بروتوكولنا منصة تمكن الباحثين من دراسة العديد من الأمراض المرتبطة بعلم الأحياء الميكانيكية. سيكون من المثير للاهتمام معرفة ما إذا كانت التغيرات في انزياح بريلوين التي ترتبط بالخصائص الميكانيكية الخلوية هي مؤشرات فعالة لمراحل تقدم المرض. سنقيم كيف تؤثر علاجات الأدوية على ميكانيكا الكروية على مدى فترات زمنية تحاكي تقدم المرض.