عزل وامتصاص الخلايا الشجيرية للحويصلات الصغيرة خارج الخلية من المشوكات الحبيبية

يركز بحثنا على توصيف المشوكات الحبيبية الحبيبية الحويصلات خارج الخلية ودورها في تفاعلات الطفيليات والمضيف. نحن نحقق في امتصاص التركيبة من قبل الخلايا المتغصنة المضيفة والتأثير المحتمل على التعديل المناعي. لقد أظهرنا أن بكتريا حبيبية EV تمتصها الخلايا المتغصنة ، مما يؤثر على النضج وعرض المستضد. نحدد أيضا البروتينات المناعية والمستضدية الرئيسية في شحنات EV ، والتي قد تؤثر على تفاعلات الطفيليات والمضيف والاستجابات المناعية.

يعمل بروتوكولنا على تحسين زراعة الطفيليات في المختبر لتحسين إنتاج المركبات الكهربائية الصغيرة ويضمن عزلا عالي الجودة ويدمج فحوصات الخلايا المتغصنة لدراسة التعديل المناعي. يمكن تطبيقه ككل أو في أجزاء. سيستكشف بحثنا المستقبلي التأثيرات في الجسم الحي للإشريكية الحبيبية على الاستجابات المناعية ، وإمكاناتها كمكونات لقاح ، وتأثيرها على الخلايا المتغصنة ، والميكروفاج ، والنماذج المناعية لهذه الخلايا.

[الراوي] للبدء ، قم بتنظيف السطح البطني للفأر القتل الرحيم بمرض الكودارية باستخدام 70٪ كحول. افتح التجويف البريتوني جراحيا لإزالة النقائل المطورة باستخدام المقص والملقط. ثم انقل كتل metacestode إلى طبق بتري معقم باستخدام ملقط. قم بإزالة النسيج الضام باستخدام ملقط ، إذا لزم الأمر ، لتحرير الأكياس من كتل النقيلي. اغسل النقائل التي تم الحصول عليها باستخدام PBS المكمل عند أربع درجات مئوية. الآن ، قم بإعداد وسط الثقافة باستخدام جميع المكونات المطلوبة ، واخلط المحلول برفق عن طريق الانعكاس. انقل خمسة ملليلتر من وسط الاستزراع المحضر إلى كل أنبوب لايتون. أضف الطفيليات إلى وسط الاستزراع واحتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة خمسة أيام دون تغيير الوسط. اجمع وسط زراعة الطفيليات من كل أنبوب لايتون وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. جهاز الطرد المركزي الوسط الذي تم جمعه عند 300 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ونقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. الآن ، قم بعمل الطرد المركزي للطافي عند 2,000 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية الناتجة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 10,000 جرام لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية لإزالة بقايا الخلايا الأصغر. باستخدام ماصة ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب مناسب لدوار الطرد المركزي الفائق. ضع علامة على جانب واحد من الأنبوب بعلامة. وضع الأنبوب في الدوار بحيث يكون الجانب المحدد متجها لأعلى. الطرد المركزي الأنابيب عند 100,000 جرام لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. اسكب المادة الطافية بسرعة واترك الأنبوب يرتاح رأسا على عقب لمدة دقيقة واحدة. اغسل الحبيبات بما لا يقل عن ثلاثة ملليلتر من PBS لإزالة البروتينات الملوثة. أعد تعليق الحبيبات عدة مرات باستخدام ماصة على طول جميع وجوه الأنبوب, مع التركيز على الجانب المحدد حيث من المتوقع أن تكون الحبيبات. بعد تكرار الطرد المركزي الفائق ، أعد تعليق الحبيبات في 30 ميكرولتر من PBS. انقل العينة المعلقة إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر وقم بتجميد الحويصلات خارج الخلية عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين. رش أنثى فأر CF-1 البالغة من العمر خمسة إلى ثمانية أسابيع بالإيثانول قبل وضعها في غطاء زراعة الأنسجة. ضع الماوس على لوح تشريح في وضع الاستلقاء. باستخدام الملقط ومقص التشريح ، قم بعمل شق T رأسي فوق مجرى البول وقم بتمديده أفقيا إلى أعلى الأطراف السفلية. باستخدام الملقط ، افصل الجلد على طول كلا الطرفين الخلفيين لكشف عظام الساق والأنسجة. باستخدام اليدين ، قم بإزالة جلد كل ساق بعد الدفع من الكاحل نحو البطن ، وسحب الجلد إلى الجانب الآخر ، وترك كلتا الساقين خالية من الجلد. الآن ، قم بإزالة عظم الفخذ والساق بعناية باستخدام المقص والملقط ، مع ضمان عدم الكسر. اربط طرف كل عظم بالملقط. وقطع الأوتار لإزالة اللفافات العضلية حول العظام. تنظيف كامل الأنسجة العضلية بالمناديل الورقية. ضع كل عظمة تمت إزالتها في أنبوب معقم سعة 50 مليلتر يحتوي على ملليلترين من وسط RPMI الكامل المكمل لإزالة الحطام. بعد التخلص من الوسط ، اغسل العظام مرتين باستخدام 70٪ من الإيثانول لمدة خمس دقائق في كل مرة. انقل العظام المغسولة إلى طبق بتري معقم واقطع المشاشية ذات العظمين باستخدام مقص تشريح حاد للوصول إلى خلايا نخاع العظام. باستخدام إبرة قياس 25 متصلة بحقنة سعة 20 مليلتر تحتوي على وسط كامل ، قم بغسل خلايا نخاع العظم بعناية من كل عظمة من العظام الأربعة في طبق بتري معقم. بعد ذلك ، قم بتجانس الوسط الذي يحتوي على نخاع مراوغ برفق عن طريق سحب العينة لإزالة الأنسجة الضامة العظمية وكتل الخلايا. انقل العينة إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مليلتر ، وتمرير الخلايا عبر مصفاة خلية بولي بروبلين معقمة 70 ميكرومتر لإزالة النسيج الضام وبقايا العظام. الطرد المركزي للخلايا على وزن 450 جم لمدة سبع دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية ، مع التأكد من بقاء الحبيبات ملتصقة بجدار الأنبوب. بعد احتضان الخلايا لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، أعد تعليقها في 500 ميكرولتر من محلول تحلل كرات الدم الحمراء وتحييد المخزن المؤقت للتحلل بثلاثة ملليلتر من الوسط الكامل. الطرد المركزي للخلايا على وزن 450 جم لمدة سبع دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من الوسط الكامل. بعد تصفية العينة كما هو موضح ، عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. أضف 300 نانوجرام لكل مليلتر من تيروزين كيناز ثلاثي الليجاند المرتبط ب FMS المؤتلف ، أو FLT3L ، إلى وسط الاستزراع. ضع الخلايا في صفيحة متعددة الآبار بتركيز واحد في 10 أس ست خلايا لكل مليلتر. احتضان الخلايا لمدة سبعة أيام عند 37 درجة مئوية في جو مرطب به 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الثالث ، قم بإزالة مليلتر واحد من الوسط من كل بئر دون إزعاج الخلايا ، واستبدله بمليلتر واحد من الوسط الكامل الطازج الدافئ مسبقا ، مع استكمال 150 نانوغرام لكل مليلتر من الفئران المؤتلف FLT3L. كانت الحويصلات خارج الخلية ، أو EVs ، المنقاة من مرحلة يرقات المشوكات الحبيبية في الأساس مركبات كهربائية صغيرة بأحجام تتراوح من 50 إلى 200 نانومتر ، مؤكدة من خلال تشتت الضوء الديناميكي والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال. أظهرت الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظام تمايزا مورفولوجيا على مدى سبعة أيام ، حيث تطورت من خلايا مكونة للدم صغيرة مستديرة إلى خلايا نجمية الشكل ذات امتدادات سيتوبلازمية. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، التقطت الخلايا المتغصنة المركبات الكهربائية الصغيرة ذات العلامات الفلورية ، والتي شاركت في توطين جزيئات MHCIII في مقصورات الحالة الداخلية ، كما أكد الفحص المجهري متحد البؤر.