فحوصات التألق المناعي الآلي المتعدد الإرسال عالية الإنتاجية للأبحاث الانتقالية

نحن نعمل على تطوير مجموعات لمقايسات التألق المناعي متعدد الإرسال السريع والحساس. الهدف هنا هو مساعدة الباحثين على تحديد أنواع الخلايا المختلفة التي تظهر في أنسجة FFPE

يتم إجراء التألق المناعي عادة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المسماة بالصبغة أو المسمى بالبيروكسيداز. تميل الكيمياء المناعية إلى أن تكون منخفضة الترطيب. تعاني الأجسام المضادة الثانوية ذات العلامات الصبغية من انخفاض الإشارة. تعد فحوصات تضخيم إشارة التيراميد شاقة للتحسين وتستغرق عدة ساعات إلى عدة أيام للتشغيل.

تأتي علامات المقايسات محسنة مسبقا وهي أسرع بكثير من التقنيات الأخرى. يستغرق الوقوف بأربع علامات أقل من ثماني ساعات ، وحوالي ثلاث ساعات أخرى لكل أربعة مؤشرات حيوية إضافية.

ستمكن القدرة على تشغيل التألق المناعي المتعدد الإرسال بشكل أسرع من تطبيق البروتينات المكانية على نطاق أوسع وستقلل من الحاجز أمام فهم السياق المكاني للأنسجة.

[الراوي] للبدء ، قم بإذابة جميع كواشف المجموعة في درجة حرارة الغرفة. قم بتخزين مترافقات الجسم المضاد ، وإنزيم التضخيم ، وبادئ التبادل ، وتبادل المعادل عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام. دوامة مخفف للأجسام المضادة المذابة. ماصة الجسم المضاد المخفف في وعاء. باختصار جهاز طرد مركزي وإضافة جميع الأجسام المضادة إلى محلول تلطيخ الجسم المضاد 1 الحاوية. أضف مخفف الجسم المضاد المقدم عند تخفيف من 1 إلى 100. ثم استخدم ماصة لخلط المحلول برفق ، وتجنب الدوامة. دوامة المحلول المختلط قبل التضخيم بعد الذوبان لخلط جيدا. ثم أضف المحلول إلى حاوية المزيج المعنية. تمزج دوامة المخزن المؤقت للتضخيم والماصة إنزيم التضخيم. قم بتخفيف إنزيم التضخيم بنسبة 1 إلى 10 في المخزن المؤقت للتضخيم لإنشاء المخزن المؤقت للتضخيم. تخلط برفق عن طريق سحب العينة ، مع تجنب الدوامة. ثم الدوامة والطرد المركزي لمحلول البقع النووية المقدم وتخفيف 1 إلى 100 في ماء فائق النقاء. بعد ذلك ، قم بتخفيف مجسات الفلورسنت 1 محلول بنسبة 1 إلى 20 في المخزن المؤقت للمسبار. أدخل عصا الكاشف الكاملة في الأداة للسماح بقياس أحجام الكاشف. انتقل إلى علامة التبويب إعداد الشريحة في الجزء العلوي من برنامج الملطخ التلقائي بمجرد تحضير جميع الكواشف. انقر فوق الزر إضافة دراسة وأدخل معرف الدراسة واسم الدراسة وأي تعليقات على الدراسة حسب الحاجة. ضمن حجم الاستغناء ، حدد 150 ميكرولترا واختر * إزالة الشمع 4 خطوات كطريقة تحضير. إذا لم يكن متوفرا في القائمة المنسدلة، فافتح قائمة إعداد البروتوكول، وحدد خانة الاختيار المفضلة له، وانقر فوق موافق. بعد إنشاء الدراسة ، انقر فوق الزر "إضافة شريحة" الموجود على الجانب الأيمن من شاشة إعداد الشريحة. أدخل اسما فريدا للشريحة ضمن تعليقات الشريحة. اضبط نوع الأنسجة لاختبار الأنسجة في المجال المناسب. ثم اختر 150 ميكرولترا لحجم الاستغناء واضبط وضع التلوين على فردي في القائمة المنسدلة اليسرى والروتين في القائمة المنسدلة اليمنى. ضمن العملية ، اختر IHC ، واضبط العلامة على محلول تلطيخ الأجسام المضادة. في قسم البروتوكولات في نافذة إضافة شريحة، حدد فحص التلوين 1 للتلطيخ، *إزالة الشمع 4 خطوات للتحضير، و*HIER 20 دقيقة مع ER2 ل HIER. اترك بروتوكول الإنزيم معينا على شرطة علامة النجمة، ثم انقر فوق إضافة شريحة عند اكتمال كافة الحقول. بعد إضافة كافة الشرائح، أغلق نافذة إضافة شريحة واطبع تسميات الشرائح، مع لصق كل منها على قسم الأنسجة المقابلة. قم بتحميل كل شريحة مصنفة على الدرج وضع بلاط الغطاء أعلى كل قسم من المناديل. أدخل درج الشرائح في الجهاز وحدد المصبغة التلقائية المقابلة من الجانب الأيمن من شاشة البرنامج. تأكد من أن جميع أدراج الشرائح الثلاثة وجميع معلومات الكاشف، بما في ذلك الكواشف المجمعة والمحضرة، مرئية. تحقق من أن حاويات الكاشف السائبة مملوءة بشكل كاف وأن حاويات النفايات لديها حجم كاف لإكمال التشغيل. ثم اضغط على زر التشغيل لبدء تشغيل التلوين وضمان إزالة الشرائح في الوقت المناسب من الملطخ التلقائي بمجرد اكتمال الإجراء. ضع الشرائح الملطخة في المخزن المؤقت PBS وقم بتطبيق زلات الغطاء باستخدام وسيط التثبيت. قم بتصوير الشرائح باستخدام مجهر مضان أو ماسح ضوئي كامل للشرائح مع مرشحات متوافقة مع أصباغ الفحص. بالنسبة لمقايسة التبادل ، قم بإذابة المخزن المؤقت للتبادل في درجة حرارة الغرفة. احتفظ بمعادل التبادل وبادئ التبادل مخزنا تحت الصفر 20 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام. قم بإعداد حاويتين للمعايرة بالتحليل الحجمي للكاشف واسترجع مجموعة الكشف لاستخدامها أثناء بروتوكول التبادل. دوامة المخزن المؤقت للتبادل. وخلط الماصة بادئ التبادل. قم بإعداد محلول التبادل في الحاوية المخصصة له عن طريق خلط الكميات المطلوبة من بادئ التبادل ومخزن الاستبدال. امزج المحتويات عن طريق سحب العينات فقط. الآن اجمع بين محلول مجسات الفلورسنت 2 مع المخزن المؤقت للتبادل المخفف في الحاوية المعنية. الدوامة فقط المخزن المؤقت للمسبار ومزيج مسبار الفلورسنت والماصة يخلطون المحلول النهائي. ضع عصا الكاشف الكاملة مع جميع الكواشف المعدة على الملطخ التلقائي. اسمح للآلة بإجراء اختبار تراجع على جميع الكواشف. بعد إضافة الشرائح، اضبط العلامة على *سلبي. وبالنسبة للتحضير و HIER و Enzyme ، حدد خيار اندفاعة علامة النجمة ، حيث لا يلزم إزالة الشمع أو استرجاع المستضد لبروتوكول التبادل. انقر فوق إضافة شريحة عند الانتهاء. بعد إضافة كافة الشرائح، أغلق نافذة إضافة شريحة واطبع تسميات الشرائح المراد لصقها على كل قسم من أقسام الأنسجة المقابلة. قم بتحميل كل شريحة على الدرج وضع بلاط غطاء فوق كل قسم من المناديل قبل وضع الدرج في الملطخ التلقائي. الآن اضغط على زر التشغيل لبدء الجري. أظهرت صور نواة المصفوفة الدقيقة للأنسجة التي تم التقاطها عبر جولتين من التلوين باستخدام بروتوكول التألق المناعي ثمانية البلطينات علامات مناعية مميزة في كل جولة ، مع تسجيل مشترك ناجح للصور يجمع بين كلتا الجولتين في مركب موحد. مكن تصوير الشرائح الكاملة لأنسجة سرطان القولون والمستقيم من تحديد الأنماط الظاهرية المناعية بناء على تحديد موقع العلامات ، بما في ذلك الخلايا التائية التنظيمية ، والخلايا التائية المنهكة ، والضامة المثبطة للمناعة. أظهر تلطيخ التألق المناعي تعبيرا مشتركا عن CD3 و CD4 و FoxP3 في الخلايا التائية التنظيمية. PD1 و PDL1 في الخلايا السرطانية واللحمة. CD3 و CD8 و PD1 في الخلايا التائية السامة للخلايا المستنفدة. و CD 68 و PDL1 في البلاعم المثبطة للمناعة. أكدت المقارنة بين الكيمياء المناعية ذات العلامة المفردة والتألق المناعي الفردي أو متعدد الإرسال التوافق النوعي في أنماط التلوين عبر جميع العلامات. أكد تلطيخ المقطع التسلسلي عبر أنواع مختلفة من الأنسجة أنماط تعبير متسقة للعلامات المناعية ذات النوى التمثيلية للأنسجة ، مما يدل على تلطيخ ناجح والحد الأدنى من التباين. أظهرت أقسام اللوزتين الملطخة في ست شرائح تسلسلية ل CD8 قابلية عالية للتكرار مع توزيع إشارة متطابق تقريبا عبر جميع الصور. أظهر القياس الكمي لكثافة الخلايا الإيجابية عبر أنواع الأنسجة أعلى كثافة في اللوزتين والعقدة الليمفاوية ، وأقل في الورم الميلانيني والقولون.