تقييم إشارات موت الخلية عن طريق التألق المناعي في نموذج الفئران للسكتة الدماغية الإقفارية

السكتة الدماغية الإقفارية هي السبب الرئيسي للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم. يركز عملنا على أهداف الأدوية للسكتة الدماغية. نحن مهتمون بالعديد من الأهداف الناشئة ، مثل RUNX1 والكاتيبسينات. لتقييم هذه الأهداف ، قمنا بتطوير نموذج الفئران للسكتة الدماغية الإقفارية عن طريق انسداد الشريان الدماغي الأوسط.

نقوم بنمذجة السكتة الدماغية الإقفارية في الفئران عن طريق إدخال خيوط لسد الشريان الدماغي الأوسط. نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط هو نموذج القوارض الأكثر استخداما لدراسات السكتة الدماغية قبل السريرية جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى ، مثل TTC والتألق المناعي وتلوين TUNEL. يمكننا استكشاف الفيزيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية في نهج متكامل. هناك بعض التحديات التقنية للتألق المناعي ، مثل خصوصية الأجسام المضادة التي تقلل من خلفية التألق وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء من خلال تسخير خصائص الملصقات الفلورية والأجسام المضادة المحددة. يسمح لنا التألق المناعي بفهم المشهد المعقد للعمارة الخلوية ، والتفاعلات الجزيئية مع نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط.

من المحتمل أن يكون هناك عدد من أنسجة المخ يمكن إنقاذه من خلال نافذة زمنية مناسبة للسكتة الدماغية. تظهر نتائجنا أن التعبير عن الكاثيبسين B يتم تنشيطه في عدد أدمغة الفئران بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط. يرافقه زيادة موت الخلايا المبرمج. قد تفيد الدراسات الإضافية حول الآلية الكامنة وراء إشارات موت الخلية هدفا جديدا للدواء.

في دراستنا المستقبلية ، سنواصل استكشاف الأهداف الجزيئية المحتملة في المسارات الالتهابية وإشارات موت الخلايا. نأمل أن تترجم بعض هذه الأهداف التي اكتشفتها الدراسات التجريبية إلى علاج سريري ، وبالتالي تحسين البقاء على قيد الحياة ونوعية الحياة لمرضى السكتة الدماغية.

[الراوي] للبدء ، ضع الجرذ المخدر في وضع ضعيف وحافظ على درجة حرارة جسمه عند 36.5 درجة مئوية باستخدام حصيرة حرارية منظمة ومسبار لمراقبة درجة حرارة المستقيم. احلق جلد الرقبة وقم بتطهيره باستخدام محلول مطهر باليودوفور. بعد ذلك ، قم بعمل شق خط الوسط بطول 2 سم في الرقبة وسحب الأنسجة الرخوة لكشف الأوعية السباتية. باستخدام الملقط، يعزل الشريان السباتي المشترك الأيمن، أو CCA، والشريان السباتي الخارجي، وECA، والشريان السباتي الداخلي، ICA. اربط CCA الأيمن القريب باستخدام الغرز. ثم قم بتثبيت ICA و ECA الصحيحين في أصلهم باستخدام مشبك صغير. أدخل خيوطا أحادية من النايلون مطلية بطرف سيليكون دائري في تجويف CCA من خلال شق صغير واربط عقدة في CCA لمنع النزيف وإزاحة الشعيرات الأحادية. افتح مشبك ICA الأيمن وأدخل الشعيرات الأحادية في الشريان الدماغي الأوسط الأيمن، أو MCA، من خلال جذع ICA حتى يحجب طرف السيليكون أصل MCA. اقطع الجزء المكشوف من الشعيرات الأحادية المصنوعة من النايلون وأغلق شق خط الوسط. بعد ساعتين من انسداد MCA ، افتح شق الرقبة ، وفك العقدة في CCA. ثم اسحب الشعيرات الأحادية من النايلون لإعادة إنفاذ MCA. بعد الجراحة ، راقب الجرذ أثناء التعافي من التخدير في قفص ساخن يتم الحفاظ عليه بحصيرة تسخين منظمة لدرجة الحرارة. باستخدام مقياس Zaya للتصنيف السلوكي الطويل ، قم بتقييم الوظيفة العصبية بعد ساعتين من انسداد الشريان الدماغي الأوسط ، أو MCAO ، وبعد 22 ساعة من إعادة التروية. بعد عزل الدماغ بالكامل عن فأر نموذج MCAO ، قم بتجميد الدماغ عند -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قطع الدماغ المجمد إلى ست شرائح إكليلية بمسافة 2 مم بين الشرائح. تلطخ الشرائح ب 2٪ TTC لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام. ثم قم بإصلاح شرائح الدماغ بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. قم بتصوير الشرائح الملطخة باستخدام كاميرا رقمية مضبوطة على الوضع التلقائي للكائنات المقربة. انقل الصور إلى جهاز كمبيوتر واستخدم برنامج ImageJ لقياس حجم الاحتشاء. احسب حجم الاحتشاء كنسبة مجموع مساحة الاحتشاء في جميع الشرائح الست إلى مجموع مساحة الدماغ الكلية في نفس الشرائح. لوحظت مناطق احتشاء كبيرة في مجموعة MCAO مقارنة بعدم وجود احتشاء في المجموعة الوهمية. لتحليل التألق المناعي ، قم بإصلاح الدماغ السليم من فأر نموذج MCAO في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة. ثم قم بتجفيف الدماغ في سلسلة من تدرجات محلول السكروز بتركيزات 10٪ و 15٪ و 30٪ ، بتركيزات 10٪ و 15٪ و 30٪ ، مع الاستمرار حتى تغرق الأنسجة. قم بتضمين الدماغ المجفف في مركب درجة حرارة القطع الأمثل وإزالة أي فقاعات هواء. المفاجئة تجميد الدماغ في النيتروجين السائل. في ناظم البرد ، قسم الدماغ بسمك 5 ميكرومتر. بعد موازنة أقسام الدماغ المجمدة في درجة حرارة الغرفة ، اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS معقم لمدة 5 دقائق لكل منها. حدد الأنسجة بقلم الكيمياء المناعية قبل احتضانها ب 20 ميكروغرام لكل مل من البروتيناز K و 0.3٪ تريتون X-100 في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد غسل الأقسام باستخدام PBS ، ضع 3٪ BSA على الأنسجة المحددة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة للحظر. استبدل محلول الحجب بالجسم المضاد الأولي المناسب واحتضان الأقسام طوال الليل في الظلام عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام PBS معقم يحتوي على 0.1٪ Tween-20 لمدة 5 دقائق لكل منهما. أضف الجسم المضاد الثانوي المناسب المترافق إلى الفلوروفور المطلوب واحتضان الأقسام في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة ، مما يحميها من الضوء. بعد غسل الأقسام باستخدام PBS التي تحتوي على Tween-20 ، قم بلطخها بوسيط تثبيت يحتوي على DAPPI وقم بتغطيتها بزلات غطاء. على المجهر الفلوري ، اضبط الطول الموجي للإثارة على 488 نانومتر ، والطول الموجي للانبعاث على 520 نانومتر ، ووقت التعرض إلى 500 مللي ثانية لالتقاط قسم الدماغ الملونعصور. زادت فعالية المناعة الكاثيبسين ب بشكل ملحوظ في النواة الإقفارية لمجموعة MCAO مقارنة بالمجموعة الوهمية. ارتفع النشاط المناعي للكاثيبسين ب بشكل ملحوظ في قشرة ظلال الظلال لمجموعة MCAO مقارنة بالمجموعة الوهمية. لم يلاحظ أي فرق كبير في النشاط المناعي للقسط ب بين اللب الإقفاري والقشرة شبه الظليلية. للبدء ، قم بتجفيف شرائح الدماغ الثابتة بارافورمالدهايد من فأر نموذج MCAO في زيادة تركيز الإيثانول لمدة 35 إلى 50 دقيقة لكل منها. ثم عالج شرائح الدماغ بعامل بيولوجي شفاف من نوع زيت التربنتين 1 لمدة 35 إلى 50 دقيقة ، متبوعا بعامل التنظيف 2 لمدة 35 إلى 50 دقيقة حتى يصبح النسيج شفافا تماما. الآن اغمر شرائح الدماغ في وسائط التضمين 1 و 2 و 3 و 4 بالتتابع لمدة 60 دقيقة لكل منها. ضع شرائح الدماغ في شريط مدمج ، وأغلقها بإحكام ، واحفظها في التخزين البارد للتصلب. باستخدام الميكروتوم ، قم بقص كتلة الأنسجة عند 10 ميكرومتر ثم قم بتقطيعها عند 5 ميكرومتر. اترك أقسام المناديل تطفو في حمام مائي عند 45 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ثم انقلها إلى الشرائح. بعد التجفيف ، قم بإزالة البارافينات من أقسام الدماغ في عامل مقاصة لمدة دورتين مدة كل منهما 10 دقائق. ثم أعد ترطيب أقسام الدماغ في تقليل تركيزات الإيثانول. الآن اشطف القسم ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل منهما. بعد إزالة الرطوبة الزائدة ، أضف 100 ميكرولتر من البروتيناز K إلى كل قسم واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد غسل PBS ، ضع 100 ميكرولتر من مخزن توازن deoxynucleotidyl transferase الطرفي على كل عينة ، واحتضانه في غرفة مرطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 30 دقيقة. قم بإزالة المخزن المؤقت باستخدام ورق ماص وأضف 50 ميكرولتر من محلول عمل الملصقات من مجموعة مقايسة TUNEL. بعد ذلك ، قم بتطبيق محلول عمل DAPPI على الأقسام واحتضانه في الظلام لمدة خمس دقائق لمواجهة النوى. اشطف العينات في PBS أربع مرات لمدة 5 دقائق لكل منها. قم بإزالة السائل الزائد وأغلق الشريحة بوسيط تثبيت مضاد للبهتان. امسح الشريحة الملطخة باستخدام نظام التصوير متعدد الأطياف Vectra Polaris. أظهر تلطيخ TUNEL زيادة كبيرة في موت الخلايا المبرمج ، مع وجود المزيد من الخلايا الإيجابية ل TUNEL في القشرة شبه الظلية لمجموعة MCAO مقارنة بمجموعة الوهم.