التصوير المجهري للفحص المجهري للزائفة الزنجارية والمكورات العنقودية الذهبية غير المتجانسة

تركز أبحاث مختبرنا على سبب فشل المضادات الحيوية. على وجه الخصوص ، نحن مهتمون بالخلايا القليلة التي تسمى الثباتات في مجموعات البكتيريا التي من المفترض أن تقتلها المضاد الحيوي ، لكنها يمكن أن تنجو من العلاج بالمضادات الحيوية. ويعتقد أن هذه المثابرات تتسبب في انتكاسة العدوى بعد انتهاء العلاج بالمضادات الحيوية.

لذلك نحن مهتمون بالنظر إلى التعبير الجيني والتمثيل الغذائي لهؤلاء المثابرين لفهم استراتيجيات البقاء الخاصة بهم بشكل أفضل. يتمثل التحدي الحالي للمجال المتواصل في موازنة الإنتاجية مع حساسية الخلية الواحدة. نحن بحاجة إلى مطابقة قدرة خلية واحدة على الانقسام بعد العلاج ، والتي ستؤهلها على أنها ثابتة ، مع بعض الأنماط الظاهرية القابلة للقياس التي يمكن أن تساعدنا في فهم الأعمال الداخلية للخلية.

وقد نضطر إلى القيام بذلك لآلاف الخلايا لالتقاط حتى ثابت واحد. تم تطوير بروتوكولنا ليتم تنفيذه بسهولة مقارنة بطرق شطيرة أجار غير الدقيقة أو تصنيع أجهزة الموائع الدقيقة ، والتي يمكن أن تكون صعبة من الناحية الفنية. وجدنا أن بروتوكولنا ينتج عنه تصويرا قابلا للتكرار ومستقرا بمرور الوقت بأقل قدر من المواد ، مما يعني أنه فعال من حيث التكلفة وأقل إهدار لجمع البيانات عالية الجودة.

سيستخدم بحثنا المستقبلي مزيجا من أساليب omics والخلية المفردة لدراسة كيفية استجابة مسببات الأمراض للعلاج بفئات مختلفة من المضادات الحيوية والتعافي منه. هدفنا النهائي هو الاستفادة من هذا الفهم لتطوير استراتيجيات جديدة لتحسين علاج الالتهابات السريرية. للبدء ، ضع غطاء معقم مقاس 30 ملم في الجزء السفلي من قاعدة الفولاذ المقاوم للصدأ لطبق انزلاق غطاء قابل للتبديل.

قم بربط ملحق البولي كربونات برفق في القاعدة ، مما يضمن أن انزلاق الغطاء يشكل قاعدة الغرفة وإغلاقها في مكانها عن طريق ضغط حلقة السيليكون المرفقة. ضع مقسم مخصص مطبوع ثلاثي الأبعاد مقابل زلة الغطاء مقاس 30 ملم لمنع الخلايا المشروطة من التلوث المتبادل. تحضير 1.5٪ agarose في أنبوب مخروطي 50 مل باستخدام الوسائط التي تختارها ولفها برفق للخلط.

قم بفك غطاء الأنبوب المخروطي وضعه في دورق زجاجي أو حامل آمن للاستخدام في الميكروويف. ضعي خليط الاغاروز في الميكروويف على نار عالية ، وتوقف كل ثلاث إلى أربع ثوان للدوران والخلط لمنع الفقاعات. بعد دقيقة واحدة ، تحقق مما إذا كان هناك أي أغاروز غير مذاب في الخليط.

إذا كان صافيا بشكل موحد ، اترك الاغاروز يبرد لفترة وجيزة إلى حوالي 60 درجة مئوية. أضف المضادات الحيوية أو القوالب ذات الصلة ولفها برفق للخلط ، وتجنب تكون الفقاعات. ماصة ملليلترين من الاغاروز في الغرفة مع زلة غطاء 30 ملم.

ضع برفق غطاء معقم مقاس 25 ملم فوق الاغاروز في فتحة الغرفة العلوية. اترك الوسادة تتصلب لمدة ساعة إلى ساعتين. عندما يتم ترسيخ الوسادة ، استخدم علامة دائمة ذات طرف رفيع لتحديد مواقع وهويات كل عينة على زلة الغطاء مقاس 25 ملم.

اقلب الغرفة بحيث تكون حلقة القاعدة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ متجهة لأعلى وأمسك بعناية ملحق البولي كربونات تحتها أثناء فك خيوط القاعدة. ضع قاعدة الفولاذ المقاوم للصدأ جانبا. حرك الغطاء مقاس 30 ملم ، وانزلق من وسادة الاغاروز وتخلص منه.

قم بتخفيف مزارع الخلايا الزائفة الزنجارية أو المكورات العنقودية الذهبية في PBS إلى كثافة متفرقة مناسبة لتصور الخلايا المفردة. الماصة بقوة لأعلى ولأسفل لتوزيع الخلايا بالتساوي. ضع خمسة ميكرولترات من معلقات الخلية المخففة في المواقع المحددة على وسادة الاغاروز.

بمجرد تجفيف البقع ، ضع غطاء معقم جديد بطول 30 ملم فوق الوسادة. ثم أمسك ملحق البولي كربونات بيد واحدة وأعد ربط قاعدة الفولاذ المقاوم للصدأ ببطء فوق زلة الغطاء. بمجرد إغلاق الغرفة ، تحقق مما إذا كان الاغاروز يتلامس مع سطح زلة الغطاء 30 ملم.

باستخدام الطرف الحاد للملاقط ، اضغط برفق على زلة الغطاء مقاس 25 ملم حتى يلامس الاغاروز الغطاء 30 ملم بالتساوي عبر سطحه. للبدء ، قم بإعداد الضوابط البيئية للمجهر وغرفة التصوير عن طريق ضبط درجة حرارة الحاضنة العلوية وحاضنة الغرفة الكبيرة على 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتشغيل جهاز ترطيب الغرفة.

ضع مستحضر وسادة الاغاروز في الحاضنة العلوية للمسرح وأغلق الغرفة للسماح بالتوازن. قم بإعداد برنامج MetaMorph للحصول على الصور عن طريق تكوين خوارزمية التركيز البؤري التلقائي المضمنة لاستخدام قناة الطور أثناء الاستحواذ متعدد الأبعاد. في علامة التبويب المرحلة، قم بتعيين مواضع مراحل متعددة لكل عينة، واستهداف مجالات الرؤية ذات كثافة الخلايا الموزعة بشكل موحد.

ثم في علامة التبويب اللقطات المتتابعة، قم بتكوين المدة والتكرار للحصول على الصور. في علامة التبويب الأطوال الموجية، اضبط القنوات المطلوبة للاستحواذ واضبط أوقات التعريض الضوئي بناء على شدة إشارة العينة. بمجرد تسخين وسادة الاغاروز في الغرفة ، ضع غطاء الترطيب على الحاضنة العلوية للمسرح.

بعد ذلك ، على المجهر ، قم بالتبديل من تباين الطور إلى وضع تباين التداخل التفاضلي. اضبط المكثف والحجاب الحاجز لفتحة العدسة لتحقيق إضاءة كولر مناسبة. بعد الانتهاء من التعديلات ، ارجع إلى وضع تباين الطور.

انتقل إلى كل موضع مرحلة، واضبط التركيز وأعد ضبط موضع المسرح إلى المستوى البؤري الجديد. انقر فوق الزر "اكتساب" لبدء عملية الاستحواذ متعددة الأبعاد. بعد الاستحواذ ، لتجميع الصور ، افتح MetaMorph واستخدم تطبيق مراجعة البيانات متعددة الأبعاد لتحديد القنوات أو الأطوال الموجية المطلوبة وتضمين جميع النقاط الزمنية لكل موضع مرحلة.

انقر فوق تحميل الصور واحفظ كل تجميع باسم القناة الخاص به كملف TIFF. تم إجراء تصوير بفاصل زمني لخلايا المكورات العنقودية الذهبية أظهر تلطيخ يوديد البروبيديوم مع تقدم العلاج بالمضادات الحيوية ، مما يشير إلى تلف الغشاء. أظهر تصوير Pseudomonas aeruginosa أثناء العلاج بالمضادات الحيوية الخلايا التي تخضع لتكوين البلاستيدات الكروية ، والخيوط ، والتكثيف السيتوبلازمي ، مصحوبة بتلوين يوديد البروبيديوم.

مكن إعداد وسادة الاغاروز الناجحة وظروف التصوير من مراقبة المكورات العنقودية الذهبية التي تتعافى من العلاج بالمضادات الحيوية والزائفة الزنجارية التي تتعافى من العلاج بالمضادات الحيوية لتشكيل مجموعات كبيرة مشتقة من خلايا مفردة.