تصوير مباشر لإعادة تدوير الحويصلة المشبكية في الوصلة العصبية العضلية لسمك الزرد اليرقي المقطوع

ندرس الآلية الجزيئية والخلوية للانتقال المشبكي باستخدام الوصلة العصبية العصبية الذكورية لسمك الزرد اليرقي كنظام نموذجي. نحن مهتمون بتوضيح الاعتدال التنظيمي للمشابك استجابة لمختلف الحالات الفسيولوجية والمرضية. يسمح لنا هذا البروتوكول بتصور انتقال جديد ناتج عن جهد الفعل في الوصلة العصبية العضلية لسمك الزرد اليرقي مع تحسين الحساسية.

يمكننا مراقبة الوظيفة المشبكية الناتجة عن التحفيز المعتدل ، والتي لم يتم اختبارها من قبل. يمكن إجراء بروتوكول التصوير هذا تحت مجهر التألق التقليدي ولا يتطلب بالضرورة مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر. بمعنى آخر ، توفر هذه الطريقة منصة فعالة من حيث التكلفة لتصوير الوظيفة العصبية العضلية مقارنة بالإعدادات التجريبية الأخرى.

لتحضير 200 مل من المحلول خارج الخلية ، امزج 6.4 مل من كلوريد الصوديوم 3.5 مولار ، و 0.4 مل من كلوريد البوتاسيوم المولي ، و 1 مليلتر من HEPES مولاري واحد ، و 0.4 ملليلتر من كلوريد الكالسيوم المولي ، و 0.2 مل من كلوريد المغنيسيوم المولي ، و 360 ملليغرام من الجلوكوز. ثم أضف الماء عالي النقاء ليصل الحجم الإجمالي إلى 200 مل. أضف 20 ميكرولترا من محلول مخزون D-tubocurarine سعة 15 ملليمولار لتحضير 100 مل من المحلول خارج الخلية مع 3 ميكرومولار D-tubocurarine.

لتحضير 25 مل من المحلول خارج الخلية الذي يحتوي على 0.02٪ tricaine ، أضف 0.5 مل من محلول مخزون 1٪ tricaine إلى 25 مل من المحلول. باستخدام مجتذب ماصة صغيرة ، اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية ثيتا حتى يبلغ قطر الطرف في حدود 3 إلى 10 ميكرومترات. املأ الماصة بالمحلول خارج الخلية.

أدخل سلكا بلاتينا رفيعا في كل فتحة من الشعيرات الدموية، وأمسك قطب الماصة الزجاجية ثيتا على حامل الماصة للمناور الصغير الآلي. ثم قم بتوصيل الواجهة الخلفية لكل سلك بعزل التحفيز. للحصول على 25 مل من المحلول خارج الخلية الذي يحتوي على 0.02٪ tricaine في طبق بتري زجاجي ، انقل يرقات سمك الزرد إلى طبق بتري للتشريح.

استخدم ملقطين دقيقين لتقشير جلد اليرقات. استخدم الملقط الأول لتثبيت اليرقات في مكانها واضغط على الجلد على الجانب الظهري من المثانة باستخدام الملقط الآخر. ثم باستخدام مشرط ، قم بإزالة مثانة السباحة والأعضاء الداخلية والرأس.

استخدم ماصة باستور زجاجية ذات طرف مصقول بالنار لنقل عينة الزرد المقطوعة إلى غرفة التصوير. قم بإصلاح العينة ميكانيكيا بخيط من النايلون يتم لصقه بسلك بلاتيني على شكل حرف C لتوجيهه بزاوية موازية تقريبا للقطب الكهربائي المحفز. قم بنشر العينة باستخدام نظام تدفق الجاذبية بمعدل 1 مليلتر في الدقيقة بمحلول خارج الخلية يحتوي على 3 ميكرومولار D-tubocurarine.

بعد ذلك ، أدخل قطب التحفيز في الحبل الشوكي. ضع طرف القطب بعناية بالقرب من الخلايا العصبية الحركية الشوكية ، والتي تم تحديدها على أنها الخلايا العصبية الإيجابية ل TagRFP الموجودة على الجانب البطني من الحبل الشوكي. تقدم القطب بزاوية مائلة من الجزء المجاور إلى الموضع المستهدف.

للبدء على جهاز كمبيوتر، حدد منطقة التصوير استنادا إلى الصورة الحية لفلورة TagRFP. تأكد من أن المنطقة المختارة تتضمن عدة أعوات وتستبعد تلك القريبة من حدود جزء الجسم. قم بتبديل وحدة مرشح التألق GFP الفلور للتصوير.

بعد ذلك ، اضبط شدة مصدر الضوء للحصول على صورة ساطعة في وضع الفاصل الزمني 1 هرتز دون تشبع. أدخل وقت التعريض الضوئي إلى 100 في حقل التعرض بالمللي ثانية في نافذة المدير الصغير. قم بتكوين برنامج الحصول على الصور وجهاز إخراج الإدخال الرقمي لمزامنة الحصول على الصور مع التحفيز الكهربائي.

بعد ذلك ، حدد تردد التحفيز وعدد إمكانات الفعل والتأخير الزمني بين بدء الحصول على الصورة وتسليم التحفيز في نص Arduino. استنادا إلى هذه الإعدادات، احسب العدد الإجمالي للصور المطلوبة للاقتناء وأدخل هذه القيمة في حقل الجرد في نافذة الاكتساب متعددة الأبعاد في المدير الصغير. قم بتعيين فاصل زمني مدته ثانية واحدة في حقل الفاصل الزمني لتصوير الفاصل الزمني بفاصل زمني 1 هرتز.

للتحفيز الكهربائي ، قم بتكوين عازل التحفيز لتوصيل نبضات جهد ثابت 1 مللي ثانية تبلغ 70 مللي فولت. قم بتنفيذ الأمر digitizer لبدء الحصول على الصور. راقب العملية للتحقق من عدم وجود انحراف غير مقبول للصورة وأن الفلور والاستجابات يمكن ملاحظتها.

قم بتعديل شدة التحفيز ، مثل التردد في عدد النبضات ، أو ضبط درجة الحرارة بناء على الغرض التجريبي. احفظ صور اللقطات المتتابعة كحزمة سلسلة زمنية TIFF. تم اختيار نقاط الاشتباك العصبي ذات الزيادات الكبيرة في الإشارة للتحليل ، على الرغم من أن جميع العصبات أظهرت تغييرات يمكن اكتشافها في حالة جهد الفعل 20 هرتز 100 ، لوحظت استجابات قوية من الفلور عند التحفيز الكهربائي عالي التردد مع تغيرات مضان تشير إلى إفراز الخلايا أثناء التحفيز والاضمحلال اللاحق ، مما يعكس الالتقام الخلوي وإعادة تحمض الحويصلات المشبكي.

اختلفت ثوابت وقت اضمحلال التألق باختلاف التحفيز والشدة ودرجة الحرارة مع 20 هرتز 25 جهد فعل تظهر عند 16.6 ثانية ، و 20 هرتز 100 جهد فعل في 56.8 ثانية ، و 50 هرتز 500 جهد فعل في 62.7 ثانية.