تحضير الصفائح الدموية البشرية المغسولة لدراسات التدفق الأيضي الكمي

لقد درست تأثير التعرض الحاد للإستروجين على التمثيل الغذائي للكربون المركزي للصفائح الدموية والصفائح الدموية التي تنشط بالثرومبين أثناء الراحة. نحن نحاول تحديد ما إذا كان التعرض الحاد للإستروجين على الصفائح الدموية يساهم في زيادة مخاطر التخثر المنقولة عن طريق استخدام وسائل منع الحمل الفموية. تعاني أبحاث صحة المرأة من نقص التمويل إلى حد كبير.

كان هذا المشروع جزءا من دعوة أكبر من المعاهد الوطنية للصحة لمعالجة الفجوات في المعرفة حول صحة المرأة. على الرغم من توفر وسائل منع الحمل لأكثر من 50 عاما ، إلا أننا ما زلنا لا نعرف الآلية الدقيقة التي تؤدي إلى زيادة خطر التخثر. التباين البيولوجي.

لا تنطبق تقنيات زراعة الخلايا التقليدية على الصفائح الدموية ، مما يعني أن الصفائح الدموية تأتي من متبرعين لديهم أنماط وراثية مختلفة. هناك حاجة إلى أحجام عينات كبيرة ، مع التأكيد على الحاجة إلى إجراء عزل الصفائح الدموية القابل للتكرار. تتم كتابة بروتوكولات غسل الصفائح الدموية الحالية للخبراء في مجال بيولوجيا الصفائح الدموية.

هناك عدد من التحديات الفريدة المرتبطة بالعمل على الصفائح الدموية التي يسلط بروتوكولي الضوء عليها لباحث الصفائح الدموية المبتدئ. للبدء ، قم بتسخين الحمام المائي مسبقا إلى 37 درجة مئوية وضع المخزن المؤقت المعدل للتيرود الذي يحتوي على الجلوكوز فيه. اجمع الدم الكامل الذي تم جمعه من جميع المكانس الكهربائية في أنبوب مخروطي بولي بروبيلين سعة 50 مل.

باستخدام طرف ماصة مقطوع مشطوط، خذ حجم عينة مناسبا لإجراء عد الخلايا. قم بالشفيق بعناية باستخدام ماصة نقل ضيقة التجويف لإزالة أي فقاعات متولدة. ثم اترك الدم يرتاح في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.

لمنع التنشيط أثناء الطرد المركزي ، أضف البروستاجلاندين I2 والذنب إلى الدم الكامل واقلب الأنبوب مرة واحدة لخلط العينة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للدم كله عند 250 جم لمدة 15 دقيقة دون انقطاع عند 37 درجة مئوية. اجمع البلازما الغنية بالصفائح الدموية ، والتي تظهر كطبقة صفراء عليا فوق الطبقة المصفرة وطبقة الدم الحمراء في أنبوب مخروطي جديد مائل سعة 50 مليلتر على طول الجدار.

اترك البلازما الغنية بالصفائح الدموية ترتاح لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، امزج البلازما الغنية بالصفائح الدموية مع 500 نانومولار من البروستاجلاندين I2 و 0.02 وحدة لكل مليلتر من الأبيراز. الطرد المركزي للخليط عند 1 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية بدون تسارع وبدون انقطاع.

الآن باستخدام ماصة نقل بلاستيكية عريضة التجويف ، قم بشفط المادة الطافية للحجم السائب ثم استخدم ماصة سعة مليلتر واحد بطرف غير مقطوع لشفط السائل المتبقي بالقرب من الحبيبات. ثم أضف البروستاجلاندين I2 والمخزن المؤقت للتيرود المحتوي على الأبيراز إلى الحبيبات ، أسفل جانب الأنبوب المخروطي. باستخدام طرف مائل مقطوع وطرف ماصة سعة مليلتر واحد ، قم بتعليق الحبيبات برفق عدة مرات.

بمجرد إعادة تعليق الحبيبات ، استخدم ماصة نقل واسعة التجويف لنقلها إلى أنبوب مخروطي جديد ، تاركا وراءها أي خلايا حمراء أو خلايا متكتلة بشكل واضح. ثم خذ عينة لقياس التدفق الخلوي باستخدام طرف ماصة مقطوع شطوبة. احتضان باقي الصفائح الدموية لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية لتمكين المثبطات من التلاشي.

بعد الحضانة ، امزج العينة برفق باستخدام ماصة ذات تجويف عريض وقم بتقطيع العينات لقياس التدفق الخلوي. كان متوسط تعافي الصفائح الدموية من الدم الكامل حوالي 52٪ مع بقاء تلوث خلايا الدم البيضاء أقل من 0.1٪ بعد عملية الغسيل. كان التعرض ل P-selectin منخفضا طوال عملية الغسيل ، ولكنه زاد بشكل ملحوظ بعد العلاج بالثرومبين.

ارتفعت مستويات الفيبرينوجين المرتبطة في البداية بعد أول دوران 1 ، 000G ، لكنها انخفضت إلى أقل من 5٪ بعد الدوران الثاني ، وزادت مرة أخرى بشكل ملحوظ بعد العلاج بالثرومبين. تم بوابات الصفائح الدموية بنجاح من حيث الحجم ، والمفردات ، وإيجابية CD42a قبل قياس علامات التنشيط. أدى العلاج بالثرومبين إلى زيادة كبيرة في تعبير P-selectin والفيبرينوجين مقارنة بالسيطرة.

للبدء ، احصل على الصفائح الدموية المغسولة من عينات الدم البشري. بعد التبريد المسبق لجهاز الطرد المركزي الدقيق إلى صفر درجة مئوية ، اجمع تعليق الصفائح الدموية في محلول ملحي عادي مجمد جزئيا بنسبة 1: 6. الطرد المركزي الخليط على حرارة 16 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند صفر درجة مئوية.

شفط المادة الطافية في أنبوب منفصل لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة. بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من الميثانول المبرد مسبقا: الماء عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر إلى الحبيبات المروية والدوامة بقوة لمدة دقيقة واحدة. قم بتجميد العينة في النيتروجين السائل وقم بإذابة الثلج عند صفر درجة مئوية.

الطرد المركزي التعليق مرة أخرى عند 16 ، 000G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وجمع المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. بعد تجفيف المادة الطافية طوال الليل ، أعد تعليق المستخلص الجاف في 150 ميكرولتر من الماء من الدرجة LC / MS واخلطه لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. دوامة لفترة وجيزة ونقل المستخلص إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 0.22 ميكرومتر لإزالة بقايا الخلية.

الطرد المركزي العينة لمدة خمس دقائق عند 16 ، 000 جم وأربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بإدخال 50 ميكرولترا إضافيا من الماء على الفلتر وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة خمس دقائق عند 16،000 جم وأربع درجات مئوية. أخيرا ، اجمع المرشح للتحليل.

كان إنتاج اللاكتات إيجابيا في جميع عينات المتبرعين بينما تم استهلاك الجلوكوز والأسيتات باستمرار ، مع تعزيز الثرومبين لهذه التدفقات.