تقييم البلعمة الدبقية الدقيقة لبقايا المايلين في المختبر تحت التحفيز المغناطيسي المتكرر

[مدرب] يركز نطاق دراستنا على البحث في إعادة التأهيل العصبي وعلاج المحاكاة المغناطيسية. يمكن أن يوفر هذا البروتوكول أفكارا جديدة للتحفيز المغناطيسي في استكشاف كيفية تأثيره على وظيفة واضحة. سنركز على إعادة التأهيل العصبي وعلاج التحفيز المغناطيسي في المستقبل.

[مدرب] للبدء ، احصل على رأس مقطوع الرأس لأنثى الفئران. تشريح الرأس على الجليد. باستخدام مقص ، قم بتقسيم الجمجمة لكشف الدماغ بالكامل وتسهيل إزالته بالكامل. استخدم المقص والملقط لاستئصال الأغشية والمخيخ والحصين بدقة ومعجم. نظف الدماغ ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة أي دم أو أنسجة متبقية. انقل الدماغ النظيف إلى 10 ملليلتر من محلول السكروز المعقم 0.32 مولار. باستخدام مقص جراحي مجهري ، قم بتقطيع أنسجة المخ إلى قطع للحصول على خليط من أنسجة المخ والسكروز. بعد ذلك ، انقل خليط أنسجة المخ والسكروز إلى الخالط المعقم سعة 50 مل. أضف 30 مل من محلول السكروز المعقم 0.32 مولار. استخدم الخالط الزجاجي سعة 50 مليلتر لطحن الأنسجة لمدة دقيقتين. للحصول على تجانس أنسجة المخ الملساء. تمييع أنسجة المخ متجانسة إلى 90 مل بمحلول سكروز معقم 0.32 مولاري ، واخلطه جيدا. أضف 20 مل من محلول السكروز المعقم 0.83 مولار إلى ستة أنابيب معقمة من مادة البولي بروبيلين فائقة الطرد المركزي رقيقة الجدران. ثم قم بتوزيع 15 مل من خليط الدماغ ببطء في الجزء العلوي من الأنابيب. قم بتسوية الأحجام بمحلول سكروز معقم 0.32 مولار. لجمع بقايا المايلين الخام ، قم أولا بالتبريد المسبق وجهاز الطرد المركزي الفائق عند أربع درجات مئوية. قم بالطرد المركزي للعينة عند 75,000 جم لمدة 45 دقيقة ، ثم اجمع بقايا المايلين من الواجهة بين كثافتي السكروز باستخدام ماصة مراعي معقمة. لأول فصل وتنقية متساوي التوتر ، انقل محلول بقايا المايلين الذي تم جمعه إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلترا. اضبط مستوى الصوت إلى 35 مل باستخدام PBS المعقم المبرد مسبقا ، وانقله إلى أنبوب الخالط الجديد. بعد التجانس لمدة ثلاث دقائق ، قم بتوزيع حطام المايلين المتجانس بالتساوي في ستة أنابيب طرد مركزي فائقة معقمة ورقيقة الجدران سعة 38.5 مليلتر من مادة البولي بروبلين. قم بتكوين الحجم باستخدام PBS المعقم ، ثم جهاز الطرد المركزي. بالنسبة للفصل والتنقية المتساوي التوتر الثاني ، أعد تعليق الحبيبات البيضاء الصلبة في 10 ملليلتر من PBS المعقم المبرد مسبقا للحصول على تعليق حطام المايلين. توزيع التعليق في أنابيب الطرد المركزي الفائق كما كان من قبل ، وأجهزة الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات البيضاء الصلبة في ستة ملليلتر من PBS المعقم. قسم تعليق حطام المايلين إلى ستة أنابيب طرد مركزي 1.5 ، وجهاز طرد مركزي مرة أخرى. أخيرا ، أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من PBS المعقم المبرد مسبقا بعد التخلص من المادة الطافية. قم بإذابة بقايا المايلين المطلوبة عند أربع درجات مئوية ، أو في الماء المثلج ، وأجهزة الطرد المركزي كما كان من قبل لمدة 10 دقائق. أعد تعليق بقايا المايلين في 200 ميكرولتر من محلول CFSE 50 ميكرومولار. احتضن التعليق في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة ، ثم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى. تخلص من المادة الطافية ، ثم اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS المعقم. أعد تعليق حطام المايلين في 100 ميكرولتر من PBS المعقم المبرد مسبقا للحصول على تعليق من حطام المايلين المسمى بالفلورسنت. قم بتخزين العينة على حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر. بالنسبة للتحفيز المغناطيسي المتكرر في المختبر ، اضبط تردد العلاج على 20 هرتز ، وشدة العلاج على 1٪ من أقصى شدة إخراج ، ووقت التحفيز إلى خمس ثوان. قم بتضمين فترة راحة مدتها 20 ثانية ، وقم بإعطاء 600 نبضة خلال وقت علاج واحد مدته 2.5 دقيقة. بعد التحديد المسبق لمعلمات التحفيز المغناطيسي ، قم بتثبيت اتجاه الملف بشكل عمودي على الأرض وتوجيهه لأعلى. تعقيم ملف التحفيز المغناطيسي بالكحول لمنع تلوث الخلايا. بعد إضافة 50 ضرورا صغيرا من CFSE ، قم بوضع 1,000 خلية BV-2 في 24 لوحة بئر طوال الليل ، ثم استنشق الوسط القديم بماصة ، وأضف على الفور وسطا جديدا خاليا من المصل. قم بتغيير الوسط إلى وسط خال من المصل ، وعالج الخلايا بميكروغرام واحد لكل مليلتر من عديد السكاريد الدهني لمدة 12 ساعة. بعد 12 ساعة من تدخل عديدات السكاريد الدهنية ، أضف 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من بقايا المايلين إلى الوسط للزراعة المشتركة في الظلام. إخضاع الخلايا للتحفيز المغناطيسي المتكرر ، كما هو موضح سابقا. رش الكحول على الطبق لتعقيمه قبل إعادته إلى الحاضنة. بعد فترة من الزراعة المشتركة مع شظايا المايلين ، اغسل بقايا المايلين غير الممتصة برفق باستخدام PBS. ثبت الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من PBS تحتوي على 10٪ ألبومين مصل الحمار و 0.3٪ Triton X-100 إلى الآبار واحتضنها. بعد غسل الآبار باستخدام PBS ، أضف محلول الجسم المضاد الأساسي بنسبة 100 إلى 200 في الآبار ، واحتضن في البرد. بعد ذلك ، احتضان الخلايا في جسم مضاد ثانوي بنسبة 100 إلى 300 لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة قبل التصوير باستخدام مجهر متحد البؤر. أظهرت خلايا الخلايا الدبقية الصغيرة BV-2 انخفاضا كبيرا في بلعمة بقايا المايلين بعد العلاج بعديدات السكاريد الدهنية. والتي تم عكسها عند تدخل التحفيز المغناطيسي المتكرر. أكد التحليل الكمي انخفاضا كبيرا في مساحة بقايا المايلين داخل خلايا BV-2 في مجموعة عديدات السكاريد الدهنية مقارنة بالمجموعة الضابطة ، مع زيادة ملحوظة في المجموعة المحفزة مغناطيسيا المعالجة بعديدات السكاريد الدهنية. كانت النسبة المئوية للخلايا الدبقية الصغيرة الإيجابية IBA-1 الموضعية مع حطام المايلين أقل بكثير في مجموعة LPS مقارنة بالتحكم ، بينما زاد التحفيز المغناطيسي بشكل كبير من هذه النسبة. لوحظت زيادة تعتمد على الوقت في البلعمة الدبقية الدقيقة مع المجموعة المحفزة مغناطيسيا المعالجة بعديدات السكاريد الدهنية لمجموعتنا التي أظهرت امتصاصا أعلى بكثير لحطام المايلين.