التقطيع بالتبريد والتلوين المناعي لأنسجة الأذن الداخلية للفأر: من المراحل الجنينية إلى مرحلة البلوغ

يركز بحثي على النمو العصبي للقوقعة. على وجه التحديد ، أهدف إلى الكشف عن الآليات الأساسية لتكوين SNAPS داخل القوقعة والتحقيق في العلاقة بين مرض الزهايمر وفقدان السمع. تعمل أدوات التصوير المباشر والوراثية على تحسين قدرتنا على دراسة هياكل القوقعة الصناعية والدوائر العصبية بمزيد من التفصيل ، مما يوفر رؤى أعمق حول مرونة نظام المدقق وخلطه. من خلال نشر هذا البروتوكول ، نريد مساعدة الباحثين الجدد في علم المدقق ، وخاصة أولئك الذين لم يعملوا مع القوقعة من قبل. يشرح هذا الدليل خطوة بخطوة كيفية تحضير عينات الأذن الداخلية من الفئران الجنينية وحديثي الولادة والبالغين. هدفنا هو جعل تجارب الأذن الداخلية أسهل ، والتأكد من أن النتائج موثوقة ومتسقة. يتميز التلوين المناعي للمقطع العرضي بالعديد من المزايا مقارنة بالطرق الأخرى ، مثل التلوين المناعي الكامل. يحافظ على البروتينات والأحماض النووية جيدا ، ويخلق أقساما رقيقة ثنائية الأبعاد تقريبا ، مما يجعل القياسات أكثر دقة واتساقا. تحافظ هذه الطريقة أيضا على جميع أنواع خلايا القوقعة الصناعية سليمة ومرئية ، مما يحسن عبادة التلوين المناعي. على عكس مستحضرات التثبيت الكامل ، يحافظ المقطع العرضي على الهياكل المهمة ، مثل الرباط الحلزوني ، والأوعية الدموية ، وغشاء رايسنر والغشاء العصفي.

[مدرب] للبدء ، ضع الفأر القتل الرحيم للأحداث على منصة جراحية. باستخدام مقص تشريح دقيق ، قم بعمل شق خط الوسط بعناية على طول فروة الرأس ، بدءا من الرقبة ويمتد نحو الخطم. بعد ذلك ، ضع الشفرة السفلية للمقص في الثقبة الماغنوم ، والشفرة العلوية في الجمجمة. اقطع النصف العلوي من الجمجمة حتى الأنف لإكمال القطع الثاني. أعد المقص من الرأس المقطوع جزئيا. ضع الشفرة السفلية للمقص في الجزء السفلي من الجمجمة ، والشفرة العلوية في الثقبة الماغنومية. اقطع النصف السفلي من الرأس حتى الأنف لإكمال القطع الثالث. باستخدام ملقط ومقص ناعم ، افصل بعناية أي أنسجة رخوة تحيط بالعظم الصدغي ، بما في ذلك الدماغ والعضلات والأنسجة الضامة. بعد ذلك ، ضع نصف رؤوس الفأر في آبار صفيحة مكونة من 24 بئرا تحتوي على PBS. استبدل PBS بمحلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ للتثبيت واحتضانه لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت ، اشطف المنديل ثلاث مرات لمدة خمس إلى 10 دقائق باستخدام PBS. حدد موقع العظم الصدغي أو كبسولة الأذن الداخلية داخل نصف رأس الفأر. باستخدام ملقط ناعم ، افصل بعناية الأنسجة الرخوة المحيطة بكبسولة الأذن الداخلية. بمجرد فكها ، قم بقص الأنسجة حول كبسولة الأذن الداخلية. ثم اضغط برفق على المنطقة المحيطة بكبسولة الأذن الداخلية باستخدام ملقط لتحريرها تماما. قم بتخزين عينات الأذن الداخلية في PBS عند أربع درجات مئوية. للبدء ، ضع الفأر البالغ القتل الرحيم على منصة جراحية. باستخدام مقص تشريح حاد ، قم بعمل شق خط الوسط على طول فروة الرأس ، بدءا من الرقبة ويمتد نحو الخطم. قم بطي الجلد للخلف لكشف الجمجمة أثناء القطع الأول. ضع الشفرة السفلية للمقص في الثقبة الماغنوم ، والشفرة العلوية في الجمجمة. اقطع النصف العلوي من الجمجمة حتى الأنف لإكمال القطع الثاني. أعد المقص من الرأس المقطوع جزئيا. ضع الشفرة السفلية في قاعدة الجمجمة ، والشفرة العلوية عند الثقبة الماغنومية. اقطع النصف السفلي من الرأس حتى الأنف على طول خط الوسط ، وتجنب الأذنين الداخلية. لكل نصف رأس، استخدم الملقط والمقص لفصل الأنسجة الرخوة المحيطة بالعظم الصدغي، بما في ذلك الدماغ والعضلات والأنسجة الضامة. بعد ذلك ، قم بعكس تجعيد أنسجة الجمجمة بالأصابع واستخدم الإبهام لتطبيق ضغط لطيف على الجانب السفلي من العظم الصدغي. قم بفك العظم تدريجيا من المرفقات المحيطة به. بمجرد إزالة كبسولة الأذن الداخلية ، اشطفها جيدا باستخدام PBS. ضع طبق سيلجارد مملوء بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد تحت المجهر. ضع كبسولة أذن داخلية واحدة في الطبق. افحص الأذن الداخلية بحثا عن أي أنسجة ناعمة أو عظم ملتصق ، ثم قم بإزالتها برفق. حدد النافذة البيضاوية وقم بإزالة الركاب برفق باستخدام الملقط. بعد ذلك ، باستخدام ملقط دقيق ، افتح ثقبا صغيرا في قمة القوقعة. باستخدام ماصة P20 مملوءة بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد ، اغسل القوقعة لضمان خروج السوائل ، مثل الدم المخفف أو اللمف الباطن ، من خلال النافذة البيضاوية. انقل القوقعة الثابتة إلى صفيحة مكونة من 24 بئرا مملوءة بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد. حدد الوقت واحتضنه لمدة 30 إلى 60 دقيقة مع تحريك لطيف باستخدام هزاز أو مغذي. بعد الحضانة ، اشطف العينة ثلاث مرات لمدة خمس إلى 10 دقائق باستخدام PBS. بعد الشطف النهائي ، ضع القوقعة في EDTA 1.25 ملليمولي واتركها تهتز لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند أربع درجات مئوية. بعد علاج EDTA ، اشطف القوقعة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق باستخدام PBS. للبدء ، ضع كبسولة الأذن الداخلية المقطعة في محلول سكروز بنسبة 10٪ ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، استبدل محلول السكروز بنسبة 10٪ بسكروز بنسبة 20٪ واحتضنه لمدة ساعتين أخريين. ثم استبدل محلول السكروز بنسبة 20٪ ب 30٪ سكروز واحتضان العينة طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة نصف محلول السكروز بنسبة 30٪. املأ الفراغ بدرجة حرارة القطع المثلى أو مركب OCT واترك العينة تتأرجح لمدة 30 دقيقة إلى ساعتين. انقل العينات إلى قوالب تبريد مصنفة مملوءة بمركب OCT. تحقق من اتجاه القوقعة في كتلة التبريد المدمجة. ضمان الأذن الداخلية. يواجه الجانب المقعر الجوانب الضيقة للقالب المبرد للمقاطع العرضية القوقعة الصناعية القياسية. بعد ذلك ، ضع الثلج الجاف في وعاء صغير وأضف خمسة إلى 10 ملليلتر من ثنائي ميثيل البيوتان. ضع قوالب التبريد التي تحتوي على OCT والعينة على الثلج الجاف الفقاعي لتجميد الكتلة بسرعة. انقل الكتل المبردة إلى حجرة ناظم البرد المبرد مسبقا إلى 20 درجة مئوية تحت الصفر. اسمح للعينات بالتوازن لمدة 30 إلى 60 دقيقة. باستخدام قلم رصاص أو قلم، ضع علامة على جانب كتلة التبريد المقابلة لموضع القوقعة الصناعية لضمان الاتجاه المناسب للتقسيم. بعد ذلك ، أضف مجموعة صغيرة من OCT إلى ظرف الظرف وضع كتلة التبريد عليها ، مع التأكد من أن الجانب العريض بدون أن علامة القلم الرصاص متجهة لأسفل. ضع الظرف الذي يحتوي على OCT والعينة في غرفة التبريد المبردة ، مما يسمح ل OCT بالتجميد تماما. بعد بضع دقائق ، ضع ظرف الظرف مع العينة على حامل الظرف مع إشارة علامة القلم الرصاص إلى اليمين أو اليسار. في ناظم الثلاجة ، قم بقص الكتلة باستخدام إعداد 40 ميكرومتر حتى يصبح النسيج واضحا. بمجرد ظهور الأنسجة ، احصد قسما بحجم 12 ميكرومتر باستخدام شرائح مصممة للتقطيع بالتبريد. تحقق من موقع القسم تحت المجهر. إذا اقتربت من منعطفات القوقعة الصناعية ، فاستمر في حصاد أقسام 12 ميكرومتر ، وتحقق بشكل دوري من الموضع حتى يتم تقسيم جميع لفات القوقعة الصناعية.