عزل مجموعات الخلايا النخاعية والظهارية الحية عن رئة الفأر

ندرس إصلاح الرئة بعد العدوى الفيروسية. نحن نهدف إلى فهم الآليات التي تتوسط بها الخلايا المناعية في الإصلاح الظهاري وكيف يمكن أن تؤثر إعادة التشكيل بعد الإصابة الفيروسية والإصلاح اللاحق على أمراض المرض المستقبلية. يعالج هذا البروتوكول عدم توافق هضم الرئة المحسن للخلايا الظهارية واللحمية أو الخلايا المناعية.

يتطلب بحثنا عزل الخلايا القابلة للحياة من كل من الأجزاء المناعية وغير المناعية. علاوة على ذلك ، وضعنا استراتيجية بوابة للمجموعات الفرعية الظهارية والبلاعم ، والتي نأمل أن تفيد هذا المجال. يبحث مختبرنا في الحديث المتبادل بين الخلايا المناعية والظهارية في الجهاز التنفسي في ظل ظروف مستقرة واستجابة للتحديات البيئية.

هدفنا النهائي هو تحديد أفضل السبل لتعديل هذا الاتصال لتعزيز إصلاح الأنسجة ومنع تطور المرض. للبدء ، رش الماوس بنسبة 70٪ من الإيثانول. باستخدام مقص جراحي دقيق وملقط رقم سبعة ، قم بعمل شق في البطن وقطع الجانب من خلال الصفاق.

قم بعمل قطع صغير في الحجاب الحاجز لتحرير الفراغ. ثم قم بقطع الحجاب الحاجز والقفص الصدري السفلي من تجويف الجسم لكشف الرئتين والقلب. باستخدام حقنة سعة 10 مليلتر مزودة بإبرة قياس 27 ، قم ببث الرئتين بخمسة ملليلتر من اثنين من EDTA مللي مولار في DPBS.

قطع عموديا من خلال القص وعلى طول الجانبين لفتح القفص الصدري وفضح القصبة الهوائية. استخدم مقصا دقيقا وملقطا رقم سبعة لإزالة أكبر قدر ممكن من العضلات والأنسجة الضامة دون ثقب القصبة الهوائية أو الرئتين. بعد ذلك ، لف القصبة الهوائية بخياطة 2/0 ، وضعها كما لو كانت تربطها ، لكن لا تشد.

قم بعمل شق جانبي في القصبة الهوائية وأدخل القسطرة. ثم اسحب الخيط بإحكام لتثبيت القسطرة في مكانها. نفخ الرئتين بملليلتر واحد من DPBS باستخدام حقنة.

بعد ذلك ، اسحب المحقنة ببطء لسحب DPBS. أعد نفخ الرئتين بنفس DPBS ، ومرة أخرى ، اسحب المحقنة لتجميع سائل غسل القصبات الهوائية ، أو BAL. افصل المحقنة عن القسطرة مع ترك القسطرة في حالة إدخالها.

استغن عن الصمام الذي تم جمعه في أنبوب طرد مركزي صغير. بعد ذلك ، املأ نفس حقنة المليلتر بملليلتر واحد من التباعد. قم بتوصيل المحقنة بالقسطرة وتضخيم الرئتين باختلاف.

أثناء إزالة القسطرة، شد الخيط حول القصبة الهوائية لمنع تسرب التباين. باستخدام المقص ، قم بقص القصبة الهوائية بشكل جانبي. قم بإزالة الرئتين من تجويف الجسم عن طريق قطع النسيج الضام على طول الجزء الخلفي من القفص الصدري أثناء سحب الرئتين والقصبة الهوائية لأعلى.

ثم قم بإزالة القلب من الرئتين. ضع الرئتين في خمسة ملليلتر من DPBS على الجليد. صمام الطرد المركزي عند 400 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

باستخدام ماصة ، استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من RPMI. للبدء ، قم بتشريح الفصوص الخمسة للرئتين التي تم حصادها من الفأر وتخلص من النسيج الضام. اقطع أنسجة الرئة المقطعة بالمقص لمدة دقيقة واحدة على شريحة زجاجية.

باستخدام مقص التشريح ، انقل أنسجة الرئة المفرومة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من مزيج الهضم وماصة خليط هضم الرئة لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات. أخيرا ، أضف حبيبات الخلية المستردة من BAL المعلقة في RPMI.

ضع الأنبوب بزاوية 45 درجة في شاكر مداري مضبوطة على 140 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بإزالة الأنبوب من الخلاط وضعه على الثلج. ماصة خليط هضم الرئة لأعلى ولأسفل خمس إلى ست مرات.

قم بتصفية الخليط من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب جديد سعة 50 مل. اغسل أي خلايا متبقية من خلال الفلتر وقم بتحييد الإنزيمات باستخدام 10 ملليلتر من 5٪ FBS في وسط RPMI. قم بالطرد المركزي للعينة عند 600 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

شفط المادة الطافية باستخدام شفاط فراغ. أعد تعليق بيليه الخلية في مليلتر واحد من المخزن المؤقت لتحلل ACK واحتضانه لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحلل خلايا الدم الحمراء. ثم أضف تسعة ملليلتر من PBS والماصة لأعلى ولأسفل لخلط المحلول.

مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي للعينة واستخدم شفاطة فراغية لإزالة المادة الطافية ، ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورة. قم بتصفية المعلق من خلال شبكة 64 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي دقيق لتحليل قياس التدفق الخلوي.