نموذج إعادة برمجة البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية للمقايسات في المختبر

بحث بحثنا في سلالة الخلايا الوحيدة والبلاعم ، مع التأكيد على لدونتها الرائعة وقدرتها على دمج إشارات متعددة من البيئة لتشكيل استجابة المستجيب أثناء الالتهاب وإصلاح الأنسجة والالتهابات. تم العثور على البلاعم في جميع أنحاء الجسم وتنسيق بدء وحل المناعة الفطرية والمتكيفة التي تؤثر على الأمراض المحمية والوسيطة المناعية. إعادة برمجة البلاعم هي الميزة الواعدة في هذا المجال.

أحدثت تقنية omics الناشئة ثورة في فهمنا لبيولوجيا البلاعم ، حيث قدمت نظرة ثاقبة لتنوعها الظاهري ، والخصائص الوظيفية ، وإمكاناتها البرمجية ، والأصل التنموي لهذه الخلايا. العقبة الرئيسية والمأزق في اكتشاف تمايز البلاعم والاستقطاب هي الظروف والبروتوكولات التجريبية غير المتجانسة عبر الأدبيات وعدم وجود توافق في الآراء في تعريف مصطلح البلاعم. نوضح تأثير إعادة برمجة وسيط الدواء والدهون على استقطاب البلاعم ونطور نموذجا ثلاثي الأبعاد في المختبر للتفاعل بين خلايا البلاعم والورم الأرومي الدبقي.

بالإضافة إلى ذلك ، أظهرنا أن الصفائح الدموية ترخص تمايز البلاعم المشتق من الخلية الأحادية إلى النمط الظاهري N1. للبدء ، ضع عينات الدم المحيطية المضادة للتخثر في جهاز طرد مركزي. قم بتدويرها إلى 200 جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

لاحظ فصل البلازما الغنية بالصفائح الدموية في الأعلى والجزء الخلوي ، بما في ذلك خلايا الدم الحمراء والبيضاء ، أدناه. تمييع الجزء الخلوي الذي تم الحصول عليه من الطرد المركزي الأول باستخدام PBS معقم مسخن مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة. قم بتجانس المحلول برفق قبل الشروع في الطرد المركزي المتدرج لكثافة Ficoll-Hypaque.

انقل 15 مل من Ficoll-Hypaque إلى أنبوب معقم سعة 15 ملليلترا. أضف 30 مل من الدم المخفف بعناية وببطء فوق Ficoll ، مما يضمن الحد الأدنى من الخلط بين المراحل. جهاز الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على Ficoll والدم المخفف عند 600 جم لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

باستخدام ماصة باستور معقمة سعة ثلاثة ملليلتر، قم بإزالة بعض الطبقة العلوية الصفراء. اجمع الواجهة بين الطبقة الصفراء وطبقة Ficoll بعناية باستخدام ماصة باستور معقمة. انقل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المجمعة ، أو PBMCs ، إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر يحتوي على ما لا يقل عن ثلاثة ملليلتر من PBS المعقم.

قم بتعبئة الأنبوب ب PBS معقم للوصول إلى الحجم الإجمالي من 12 إلى 15 ملليلترا. ثم الطرد المركزي للعينة عند 600 جرام لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتدوير نظام التعليق PBMC عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند 8 إلى 10 درجات مئوية.

أعد تعليق الخلايا في الحجم المطلوب من PBS البارد المعقم مع 2٪ FBS. حافظ على الخلايا عند 4 درجات مئوية حتى الخطوة التالية. انقل الحجم المطلوب من تعليق PBMC إلى أنبوب دائري القاع من البوليسترين سعة خمسة ملليلتر.

ثم أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل الاختيار الإيجابي لكل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية. امزج المعلق جيدا قبل احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتعبئة 10 ميكرولتر من الجسيمات النانوية المغناطيسية لكل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية.

قم بعمل ماصة بقوة لأعلى ولأسفل أكثر من خمس مرات لضمان تعليق موحد للجسيمات النانوية المغناطيسية. بعد حضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، أضف PBS الذي يحتوي على FBS و EDTA إلى التعليق لجعل الحجم الإجمالي يصل إلى 2.5 ملليلتر. قم بسحب الخلايا برفق لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات.

أدخل الأنبوب في فارز المغناطيس ، واتركه دون إزعاج لمدة خمس دقائق. اقلب المغناطيس مع الأنبوب بحركة واحدة مستمرة. احتفظ بالمغناطيس والأنبوب مقلوبين لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان قبل إعادتهما إلى وضع رأسي.

قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس ، ثم أضف 2.5 مل من المخزن المؤقت PBS-FBS-EDTA إلى الأنبوب مرة أخرى. قم بتحريك معلق الخلية برفق لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات لخلطه. أدخل الأنبوب مرة أخرى في المغناطيس ، واتركه بعيدا لمدة خمس دقائق.

في حركة واحدة مستمرة ، اقلب المغناطيس والأنبوب مرة أخرى ، وتخلص من الكسر الطافي. قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس ، وأعد تعليق الخلايا بحجم مناسب من PBS-FBS بدون EDTA. الخلايا المختارة بشكل إيجابي جاهزة الآن للاستخدام.

أضف الآن المخزن المؤقت PBS-FBS إلى خلايا CD14 التي تم فرزها ، مما يجعل الحجم الإجمالي يصل إلى 12 إلى 14 مليلترا لتخفيف أي EDTA متبقي. جهاز طرد مركزي عند 600 جرام لمدة 10 دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا الوحيدة CD14 المحددة بشكل إيجابي في ملليلترين من المخزن المؤقت PBS-FBS.

عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا التلقائي. احتفظ بالخلايا على الجليد حتى تحضير الثقافة. للاستزراع ، أعد تعليق الحبيبات بتركيز مليون خلية لكل مليلتر في وسط RPMI 1640 المكمل.

ماصة 250 ميكرولتر من تعليق الخلية المحضرة في كل بئر من صفيحة 48 بئرا. أضف 250 ميكرولترا من وسط RPMI المكمل بالمضادات الحيوية الذي يحتوي على 50 نانوغرام لكل مليلتر من عامل تحفيز مستعمرة البلاعم في كل بئر. احتضان لوحة زراعة الخلايا في حاضنة رطبة لبدء تمايز البلاعم.

في اليوم الرابع من تمايز البلاعم ، استبدل نصف وسط الاستزراع من كل بئر. أضف السيتوكينات أو الكواشف لظروف الاستقطاب المرغوبة ، واستمر في الزراعة لمدة ثلاثة أيام أخرى. حصاد الخلايا الوحيدة المشتقة من البلاعم في اليوم السابع لتوصيف النمط الظاهري.

أظهرت البلاعم M1 الناجمة عن عديدات السكاريد الدهنية للإنترفيرون جاما بالإضافة إلى أعلى تعبير عن CD64 ، وغياب CD206 ، ومستويات منخفضة من CD163 و MERTK. تميزت البلاعم M2a التي يسببها الإنترلوكين 4 بزيادة تعبير CD206 ، وانخفاض مستويات CD64 و CD163 و MERTK. أظهرت البلاعم M2c التي يسببها الإنترلوكين 10 أو ديكساميثازون زيادة في تعبير CD163 و CD14 ، ومستويات متوسطة من CD64 ، وزيادة في تعبير MERTK.