الكشف عن تعدد الإرسال للتعبير الجيني في دماغ ذبابة الفاكهة السليم باستخدام التألق التكراري بمساعدة التمدد في التهجين الموضعي

لقد طورنا بروتوكولا قويا حيث يمكن إجراء جولات متعددة من التهجين في الموقع على نفس ذبابة الفاكهة ، مما يتيح تصور أنماط التعبير عن العديد من الجينات المختلفة. يضمن دمج دماغ الذبابة في هيدروجيل سلامة ممتازة للأنسجة واستقرار mRNA على مدى جولات متعددة من التهجين. كما أنه يحسن بشكل كبير الوضوح البصري عند التصوير.

يمكن اعتماد EASI-FISH من قبل أي مختبر باستخدام مجهر متحد البؤر أو صفائح ضوئية لتحديد ملامح التعبير الجيني لأنواع الخلايا في دماغ الذبابة. للبدء ، امسح شريحة غير مشحونة بكاشف إزالة تلوث الحمض النووي الريبي. قم بإزالة الفيلم غير الشفاف الذي يحمي المادة اللاصقة من حشية السيليكون.

ثم قم بلصق الحشية التي تحتوي على ما يصل إلى أربع غرف بالشريحة. استخدم ماصة P20 لتغطية كل سطح حجرة بميكرولتر واحد من البولي لايسين. بعد ذلك ، قم بنقل ما يصل إلى أربعة أدمغة ذبابة الفاكهة لكل أنبوب إلى أنبوب PCR سعة 0.2 ملليلتر.

أعد ترطيب الأدمغة في 150 ميكرولتر من PBS تحتوي على 0.1٪ Triton X-100 متبوعا ب PBS. أضف 40 ميكرولتر من PBS إلى كل غرفة. باستخدام زوج من الملقط الناعم ، ضع الأدمغة برفق على التوالي في وسط الغرفة ، مع ترك بعض المسافة بينهما.

قم بإزالة PBS من الغرفة وأضف على الفور 50 ميكرولترا من 20 ملي مولار MOPS عازلة. بينما تتوازن الأدمغة في المخزن المؤقت MOPS ، تقوم الماصة بكميات متساوية من Melphalan-X المذاب في أنبوب بمخزن مؤقت MOPS متساو الحجم. ثم أضف محلول مخزون Ac-X بنسبة واحد إلى 100.

دوامة المحلول وقم بتدويره لفترة وجيزة لجمعه. قم بإزالة جميع المخزن المؤقت MOPS من الغرف وأضف 50 ميكرولترا من محلول Melphalan-X AC-X. ضع زلة غطاء أعلى كل غرفة دون استخدام لاصق الحشية للختم.

ثم ضع الغرفة في صندوق مرطب في اليوم التالي ، قم بإزالة زلة الغطاء بعناية واستنشق محلول Melphalan-X Ac-X. اغسل الأدمغة المركبة مرتين في 100 ميكرولتر من 0.1٪ PBT ، متبوعا ب 100 ميكرولتر من PBS.

ضع المحاليل المذابة من TREx-1000 4-Hydroxy-TEMPO و TEMED و persulfate الأمونيوم على الجليد. دوامة الحل TREx-1000 لضمان عدم وجود رواسب. امزج المحاليل لتحضير محلول هلام ودوامة قبل الجليد.

باستخدام طرف الماصة، قم بإزالة PBS من الغرفة وتخلص من أي سائل متبقي بمنديل خال من النسالة. أضف على الفور 40 ميكرولترا من محلول الجل على الأدمغة في كل حجرة. احتضان الغرف عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

الآن قم بإزالة محلول الجل من الغرفة. ثم انزع الفيلم الواقي الشفاف من لاصق سطح الحشية. أضف 45 ميكرولترا نهائيا من محلول الجل الطازج.

ضع زلة غطاء برفق فوق الغرفة واضغط على زلة الغطاء لإغلاق الغرفة قبل الحضانة عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق أخرى. احتضان الغرفة عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة لبلمرة الجل. بعد تبريد المواد الهلامية على مقعد ، استخدم شفرة حلاقة لإزالة زلة الغطاء وحشية السيليكون بعناية.

قم بقص الجل إلى شكل مستطيل وقم بقص الزاوية اليمنى العليا للإشارة إلى اتجاه العينة. بعد ذلك ، استخدم فرشاة رسم دقيقة مبللة بكمية صغيرة من Pro K Buffer لرفع المواد الهلامية بعناية عن الشريحة. انقل كل هلام على حدة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلترتين.

امزج 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت Pro K وخمسة ميكرولترات من إنزيم Proteinase K ، وأضف الخليط إلى كل جل. احتضن عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بإزالة المخزن المؤقت بماصة مرنة دقيقة ثم اغسل المواد الهلامية ثلاث مرات في PBS لمدة 10 دقائق لكل منها.

احتضان المواد الهلامية لمدة 30 دقيقة في مليلتر واحد من المخزن المؤقت DNASE1 عند 37 درجة مئوية. امزج 50 ميكرولترا من إنزيم DNASE1 مع 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت DNASE1. تخلط بلطف دون دوامة.

احتضان كل هلام في 500 ميكرولتر من محلول DNASE1 لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. ثم اغسل المواد الهلامية أربع مرات لمدة 15 دقيقة باستخدام مليلتر واحد من PBS في درجة حرارة الغرفة. الآن ، قم باحتضان المواد الهلامية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين المذاب بدون مجسات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

قم بتخفيف المجسات في مخزن التهجين بنسبة واحد إلى 100 ، مع تحضير 300 ميكرولتر لكل هلام. احتضان المواد الهلامية مع مخزن مؤقت للتهجين يحتوي على مجسات طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، اغسل المواد الهلامية أولا في مخزن غسيل المسبار ، ثم في PBS.

بالنسبة لتفاعل سلسلة التهجين ، أضف 500 ميكرولتر من مخزن التضخيم إلى الجل واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. سخني دبابيس الشعر الفلورية على 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية في جهاز PCR وقم بتبريد المحلول إلى 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لكل مسبار ، قم بتخفيف أزواج دبابيس الشعر المطابقة بنسبة واحد إلى 50 في المخزن المؤقت للتضخيم ، مع تحضير 300 ميكرولتر لكل جل.

بعد دوامة الخليط ، أضيفي الخليط إلى المواد الهلامية واحتضنها. لتركيب الجل لتصوير الألواح الخفيفة ، قم بتغطية سطح مرفق الجل لحامل الجل مرتين بميكرولتر واحد من البولي يسين ، واتركه يجف عند 37 درجة مئوية بين الطبقات. ثم ضع الجل على زلة غطاء بحيث يكون القطع على الجانب الأيسر.

باستخدام فرشاة الرسم ، انقل الجل إلى السطح المعالج بحركة واحدة. أظهرت الجينات المرتبطة بالناقل العصبي وجينات الببتيد العصبي أنماط تعبير مميزة في دماغ ذبابة الفاكهة البالغة. تم اكتشاف VGluT و Gad1 في نفس جولة التهجين ، مما يدل على أنماط تعبير غير متداخلة.

أظهر AstA تعبيرا قويا في الفص البصري وتعبيرا أضعف في المركب المركزي. تم التعبير عن Crz بشكل كبير في pars lateralis ، بينما لوحظت مستويات تعبير أقل في الخلايا العصبية للفص البصري. تم اكتشاف Tk في الخلايا العصبية H delta D التي تم تحديدها بتعبير Mer-GFP باستخدام خط GAL4 مقسم محدد إما عن طريق ورقة ضوئية أو فحص مجهري متحد البؤر.

كان FMRFamide غائبا في الخلايا العصبية PFG التي تميزت ب Mer-GFP ، ولكن تم اكتشافها في الخلايا العصبية المحيطة. أكد التصوير عالي الدقة للخلايا العصبية FB4K التوزيع المكاني لنصوص VGluT و ChAT / VAChT. يتم التعبير عن الببتيدات العصبية ، مثل AstA و Crz ، بشكل كبير في بعض الخلايا بحيث لم يعد من الممكن فصل البقع الفلورية الفردية التي تمثل نسخا مفردة.