تحليل استقرار البلازميد باستخدام الموائع الدقيقة ذات القطرات مفتوحة المصدر

نقوم بتطوير طرق IC عالية الإنتاجية لدراسة تنوع خلايا الخلايا والتفاعلات بين الخلية. في هذا السياق ، تمكننا قطرات الهلام الدقيقة من تنفيذ خطوات بروتوكولية مفيدة ، مثل التلاعب بالحمض النووي وتلوين التحلل والفحص المجهري بطريقة مشلولة للغاية في الخلايا المحاصرة. تشتهر تدفقات عمل Droplet microphilic بالإنتاجية العالية للغاية وتعدد الاستخدامات ، ولكن غالبا ما يكون الاعتماد محدودا بسبب الحاجة إلى أجهزة متطورة وخبرة متخصصة.

يعمل بروتوكولنا على تحسين التقنيات التقليدية باستخدام تحليل عالي الإنتاجية وحيدة الخلية مع تلطيخ الفلورسنت وسير عمل مجهري مفتوح المصدر يمكن الوصول إليه. يقوم بتغليف الخلايا في قطرات دقيقة هلامية عبر الموائع الدقيقة لتحليل الخلايا الصغيرة والمستعمرات الدقيقة في وقت واحد. في حين أن الثقافات السائبة والصفائح تفتقر إلى الخصوصية والدقة ، فإن هذه الطريقة تحتوي على إحصاءات دقيقة وتمثيلية للظواهر المتنوعة.

تجمع بروتوكولاتنا بين الموائع الدقيقة بالقطرات والفحص المجهري الفلوري والأجهزة مفتوحة المصدر بطريقة قائمة على الملصقات. يجعل هذا النهج تحليل الخلية المفردة أكثر مرونة وبأسعار معقولة ، مما يمكن المجتمع العلمي من معالجة الأسئلة العلمية المعقدة المتعلقة بالمجتمعات الميكروبية. للبدء ، قم بتسخين الاغاروز بدرجة حرارة منخفضة للغاية بتركيز 2٪ إلى 90 درجة مئوية في مرق Luria Bertani أو LB.

رجي المزيج لمدة 10 دقائق في شاكر يتم التحكم في درجة حرارته ، ثم اخفضي درجة حرارة الخلاط الحراري إلى 39 درجة مئوية لتبريد محلول الاغاروز. ضع أنبوب تعليق الإشريكية القولونية في الخلاط الحراري لمدة أربع دقائق لتسخينه إلى 39 درجة مئوية. امزج معلق البكتيريا ومحلول الاغاروز بنسبة واحد إلى واحد لتحقيق تركيز الاغاروز بنسبة 1٪ مع تعليق خلوي 3.1 في 10 إلى قوة ست خلايا لكل مليلتر.

قم بإعداد محلول التحكم السلبي لمراقبة التلوث باستخدام تعليق LB و agarose بنسبة واحد إلى واحد. احصل على منصة التدفق مفتوحة المصدر الكاملة ، بما في ذلك محركات ضغط الغاز وأجهزة استشعار التدفق. قم بتضمين شريحة زجاجية وسخانات ذات طرف ماصة في الإعداد للتحكم في درجة حرارة عينة خلية الاغاروز عند دخولها الشريحة.

بعد ذلك ، ضع شريحة الموائع الدقيقة على مرحلة الفحص المجهري المعزز بالستروب ، مما يضمن أن تقاطع توليد القطرات مرئي. اضبط سخان طرف الماصة وسخان الشريحة الزجاجية على 40 درجة مئوية باستخدام واجهة برنامج التحكم. باستخدام حقنة مع أنبوب وقابس PDMS، قم بتحميل مزيج تعليق خلايا الاغاروز بنسبة 1٪ في طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر.

أدخل الطرف في سخان الطرف وضعه على مدخل الطور المائي في شريحة الموائع الدقيقة. استبدل ختم PDMS الخاص بالطرف مع الختم المتصل بأنبوب نظام التحكم في التدفق. بعد ذلك ، أدخل أنبوب الزيت في المدخل الثاني ونهاية أنبوب المخرج في أنبوب النفايات.

ثم اضبط الضغط على 80 مللي بار لمراحل الإذعان والزيت على واجهة المستخدم ، وابدأ في ضخ تعليق الخلية والزيت. اضبط طور الزيت على 320 مللي بار ومرحلة الإذعان إلى 180 ملليبار. اترك دقيقة واحدة لتثبيت توليد القطرات.

بمجرد استقرار توليد القطرات ، انقل أنبوب المخرج من أنبوب النفايات إلى أنبوب التجميع. استمر في جمع القطرات على الجليد حتى يفرغ خزان العينة. بعد التجميع ، ضع الأنابيب على أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح لهلام الاغاروز بداخل القطرات.

احتضان قطرات الهلام الدقيقة التي تحتوي على البكتيريا وقطرات التحكم السلبية عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات أو بين عشية وضحاها لنمو المستعمرة. بعد الحضانة ، استخدم حقنة سعة ثلاثة ملليلتر بإبرة قياس 21 لإزالة أكبر قدر ممكن من الزيت بعناية من قاعدة مستحلب القطرات الدقيقة للهلام. انقل 50 ميكرولترا من قطرات الهلام الدقيقة إلى أنبوب دقيق جديد ، وقم بتخزينه على درجة حرارة أربع درجات مئوية لمزيد من تحليل القطرات ، وأضف خليطا واحدا لواحد من الزيت المفلور مع PFO بحجم يساوي المستحلب المتبقي.

بعد ذلك ، أضف ما يقرب من 200 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ فوق المستحلب. قم بتدوير الخليط ، وقم بتدويره لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي ثابت السرعة. قم بإزالة طور الزيت بعناية من أسفل واجهة السائل وتخلص من 100 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم من الأعلى.

انقل ميكرولترين من قطرات الجل الدقيقة إلى شريحة غرفة التصوير وأضف خمسة ميكرولترات من الزيت المفلور للمساعدة في تكوين طبقة أحادية من القطرات للحصول على التصوير الأمثل. على المجهر ، قم بتنشيط إضاءة مصفوفة LED البيضاء من الأعلى لتصوير المجال الساطع. قم بتركيب الشريحة المعدة.

ركز على العينة لتحديد موقع طبقة أحادية من القطرات والتقاط صورة المجال الساطع. بعد ذلك ، اضبط عجلة المرشح لتتماشى مع مرشح الطول الموجي الأخضر. قم بالتبديل إلى مصباح LED 470 نانومتر للإثارة ، وبدون تحريك العينة ، التقط صورة فلورية للمستعمرات.

انقل ميكرولترين من المواد الهلامية الدقيقة الملطخة باليوديد البروبيديوم إلى شريحة غرفة التصوير وأضف خمسة ميكرولترات من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ لتشكيل طبقة أحادية من المواد الهلامية الدقيقة. أغلق مدخل ومخرج الرقاقة لمنع التبخر أثناء التصوير. اضبط مرشح الفاصل الزمني للطول الموجي الأحمر لتصوير يوديد البروبيديوم ، والتقط الصور الساطعة والفلورسنت.

تم تأكيد تغليف الخلايا في قطرات الهلام الدقيقة بواسطة المجهر الساطع ، والذي يظهر قطرات موحدة مع خلايا مغلفة مميزة. تم تحديد المستعمرات التي فقدت التألق المشفر بالبلازميد باستخدام تحليل نسبة التألق. من بين 2 ، 785 مستعمرة تم تحليلها ، فقدت 100 مستعمرة مضان ، مما يشير إلى معدل فقدان البلازميد بنسبة 3.6٪