تحليل استقرار البلازميد باستخدام الموائع الدقيقة ذات القطرات مفتوحة المصدر
December 27th, 2024
يتم تقديم سير عمل ميكروفلويدي مفتوح المصدر يمكن الوصول إليه للتحليل الموازي لاحتباس البلازميد في البكتيريا. من خلال استخدام الفحص المجهري الفلوري لتحديد وجود البلازميد في المستعمرات الدقيقة أحادية الخلية داخل قطرات الهلام الدقيقة ، توفر هذه الطريقة بديلا دقيقا ويمكن الوصول إليه وقابلا للتطوير لعد الألواح التقليدي.
نقوم بتطوير طرق IC عالية الإنتاجية لدراسة تنوع خلايا الخلايا والتفاعلات بين الخلية. في هذا السياق ، تمكننا قطرات الهلام الدقيقة من تنفيذ خطوات بروتوكولية مفيدة ، مثل التلاعب بالحمض النووي وتلوين التحلل والفحص المجهري بطريقة مشلولة للغاية في الخلايا المحاصرة. تشتهر تدفقات عمل Droplet microphilic بالإنتاجية العالية للغاية وتعدد الاستخدامات ، ولكن غالبا ما يكون الاعتماد محدودا بسبب الحاجة إلى أجهزة متطورة وخبرة متخصصة.
يعمل بروتوكولنا على تحسين التقنيات التقليدية باستخدام تحليل عالي الإنتاجية وحيدة الخلية مع تلطيخ الفلورسنت وسير عمل مجهري مفتوح المصدر يمكن الوصول إليه. يقوم بتغليف الخلايا في قطرات دقيقة هلامية عبر الموائع الدقيقة لتحليل الخلايا الصغيرة والمستعمرات الدقيقة في وقت واحد. في حين أن الثقافات السائبة والصفائح تفتقر إلى الخصوصية والدقة ، فإن هذه الطريقة تحتوي على إحصاءات دقيقة وتمثيلية للظواهر المتنوعة.
تجمع بروتوكولاتنا بين الموائع الدقيقة بالقطرات والفحص المجهري الفلوري والأجهزة مفتوحة المصدر بطريقة قائمة على الملصقات. يجعل هذا النهج تحليل الخلية المفردة أكثر مرونة وبأسعار معقولة ، مما يمكن المجتمع العلمي من معالجة الأسئلة العلمية المعقدة المتعلقة بالمجتمعات الميكروبية. للبدء ، قم بتسخين الاغاروز بدرجة حرارة منخفضة للغاية بتركيز 2٪ إلى 90 درجة مئوية في مرق Luria Bertani أو LB.
رجي المزيج لمدة 10 دقائق في شاكر يتم التحكم في درجة حرارته ، ثم اخفضي درجة حرارة الخلاط الحراري إلى 39 درجة مئوية لتبريد محلول الاغاروز. ضع أنبوب تعليق الإشريكية القولونية في الخلاط الحراري لمدة أربع دقائق لتسخينه إلى 39 درجة مئوية. امزج معلق البكتيريا ومحلول الاغاروز بنسبة واحد إلى واحد لتحقيق تركيز الاغاروز بنسبة 1٪ مع تعليق خلوي 3.1 في 10 إلى قوة ست خلايا لكل مليلتر.
قم بإعداد محلول التحكم السلبي لمراقبة التلوث باستخدام تعليق LB و agarose بنسبة واحد إلى واحد. احصل على منصة التدفق مفتوحة المصدر الكاملة ، بما في ذلك محركات ضغط الغاز وأجهزة استشعار التدفق. قم بتضمين شريحة زجاجية وسخانات ذات طرف ماصة في الإعداد للتحكم في درجة حرارة عينة خلية الاغاروز عند دخولها الشريحة.
بعد ذلك ، ضع شريحة الموائع الدقيقة على مرحلة الفحص المجهري المعزز بالستروب ، مما يضمن أن تقاطع توليد القطرات مرئي. اضبط سخان طرف الماصة وسخان الشريحة الزجاجية على 40 درجة مئوية باستخدام واجهة برنامج التحكم. باستخدام حقنة مع أنبوب وقابس PDMS، قم بتحميل مزيج تعليق خلايا الاغاروز بنسبة 1٪ في طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر.
أدخل الطرف في سخان الطرف وضعه على مدخل الطور المائي في شريحة الموائع الدقيقة. استبدل ختم PDMS الخاص بالطرف مع الختم المتصل بأنبوب نظام التحكم في التدفق. بعد ذلك ، أدخل أنبوب الزيت في المدخل الثاني ونهاية أنبوب المخرج في أنبوب النفايات.
ثم اضبط الضغط على 80 مللي بار لمراحل الإذعان والزيت على واجهة المستخدم ، وابدأ في ضخ تعليق الخلية والزيت. اضبط طور الزيت على 320 مللي بار ومرحلة الإذعان إلى 180 ملليبار. اترك دقيقة واحدة لتثبيت توليد القطرات.
بمجرد استقرار توليد القطرات ، انقل أنبوب المخرج من أنبوب النفايات إلى أنبوب التجميع. استمر في جمع القطرات على الجليد حتى يفرغ خزان العينة. بعد التجميع ، ضع الأنابيب على أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح لهلام الاغاروز بداخل القطرات.
احتضان قطرات الهلام الدقيقة التي تحتوي على البكتيريا وقطرات التحكم السلبية عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات أو بين عشية وضحاها لنمو المستعمرة. بعد الحضانة ، استخدم حقنة سعة ثلاثة ملليلتر بإبرة قياس 21 لإزالة أكبر قدر ممكن من الزيت بعناية من قاعدة مستحلب القطرات الدقيقة للهلام. انقل 50 ميكرولترا من قطرات الهلام الدقيقة إلى أنبوب دقيق جديد ، وقم بتخزينه على درجة حرارة أربع درجات مئوية لمزيد من تحليل القطرات ، وأضف خليطا واحدا لواحد من الزيت المفلور مع PFO بحجم يساوي المستحلب المتبقي.
بعد ذلك ، أضف ما يقرب من 200 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ فوق المستحلب. قم بتدوير الخليط ، وقم بتدويره لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي ثابت السرعة. قم بإزالة طور الزيت بعناية من أسفل واجهة السائل وتخلص من 100 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم من الأعلى.
انقل ميكرولترين من قطرات الجل الدقيقة إلى شريحة غرفة التصوير وأضف خمسة ميكرولترات من الزيت المفلور للمساعدة في تكوين طبقة أحادية من القطرات للحصول على التصوير الأمثل. على المجهر ، قم بتنشيط إضاءة مصفوفة LED البيضاء من الأعلى لتصوير المجال الساطع. قم بتركيب الشريحة المعدة.
ركز على العينة لتحديد موقع طبقة أحادية من القطرات والتقاط صورة المجال الساطع. بعد ذلك ، اضبط عجلة المرشح لتتماشى مع مرشح الطول الموجي الأخضر. قم بالتبديل إلى مصباح LED 470 نانومتر للإثارة ، وبدون تحريك العينة ، التقط صورة فلورية للمستعمرات.
انقل ميكرولترين من المواد الهلامية الدقيقة الملطخة باليوديد البروبيديوم إلى شريحة غرفة التصوير وأضف خمسة ميكرولترات من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ لتشكيل طبقة أحادية من المواد الهلامية الدقيقة. أغلق مدخل ومخرج الرقاقة لمنع التبخر أثناء التصوير. اضبط مرشح الفاصل الزمني للطول الموجي الأحمر لتصوير يوديد البروبيديوم ، والتقط الصور الساطعة والفلورسنت.
تم تأكيد تغليف الخلايا في قطرات الهلام الدقيقة بواسطة المجهر الساطع ، والذي يظهر قطرات موحدة مع خلايا مغلفة مميزة. تم تحديد المستعمرات التي فقدت التألق المشفر بالبلازميد باستخدام تحليل نسبة التألق. من بين 2 ، 785 مستعمرة تم تحليلها ، فقدت 100 مستعمرة مضان ، مما يشير إلى معدل فقدان البلازميد بنسبة 3.6٪
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة سير عمل ميكروفلويدي مفتوح المصدر لتحليل احتفاظ البلازميد في البكتيريا باستخدام مجهر الفلورة. تسمح الطريقة بالقياس الدقيق لوجود البلازميد في مستعمرات خلوية مفردة مغلفة في قطرات ميكروية هلامية، مما يوفر بديلاً قابلاً للتوسيع لعد الألواح التقليدي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الميكروفلويديك
- بيولوجيا الخلية
- مجهر الفلورة
الخلفية
- تُمكّن تقنيات الميكروفلويديك التحليل عالي الإنتاجية لمجموعات الخلايا.
- غالبًا ما تفتقر الطرق التقليدية إلى الخصوصية والدقة.
- توفر القطرات الميكروية الهلامية منصة متعددة الاستخدامات لتحليل الخلايا المفردة.
- يمكن للنهج مفتوحة المصدر أن توسع نطاق الوصول إلى المنهجيات المتقدمة.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة عالية الإنتاجية لدراسة احتفاظ البلازميد في البكتيريا.
- تحسين إمكانية الوصول وكفاءة التكلفة لتقنيات تحليل الخلايا المفردة.
- توفير بديل قابل للتوسيع للطرق الثقافية التقليدية.
الطرق المستخدمة
- تحضير قطرات ميكروية هلامية من الأغاروز تحتوي على خلايا بكتيرية.
- استخدام الميكروفلويديك لتوليد القطرات وتوجيهها.
- مجهر الفلورة لتصوير وتحديد كمية احتفاظ البلازميد.
- تحليل تفلورة المستعمرات لتحديد معدلات فقدان البلازميد.
النتائج الرئيسية
- تأكيد تغليف الخلايا في قطرات ميكروية هلامية عبر مجهر المجال الساطع.
- تحديد معدل فقدان البلازميد بنسبة 3.6٪ بين المستعمرات التي تم تحليلها.
- برهنة فعالية سير العمل المفتوح المصدر لتحليل عالي الإنتاجية.
- توفير إحصائيات دقيقة عن احتفاظ البلازميد في مجموعات بكتيرية متنوعة.
الاستنتاجات
- تعزز الطريقة المطورة دراسة المجتمعات الميكروبية.
- توفر نهجًا مرنًا وبأسعار معقولة لتحليل الخلايا المفردة.
- يمكن اعتماد سير العمل هذا من قبل الباحثين بمختلف مستويات الخبرة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Plasmid stability is a critical parameter in synthetic biology and microbial engineering, directly impacting the reliability of engineered strains in biopharma R&D. High-throughput, quantitative analysis of plasmid retention without antibiotic selection enables robust target validation and de-risks early discovery workflows. Open-source droplet microfluidics democratizes access to advanced single-cell analytics, supporting scalable portfolio decisions and translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of plasmid stability in engineered microbial populations.
- Supports functional validation of genetic constructs under selection-free conditions.
- Provides high-resolution data for mechanistic de-risking of synthetic circuits.
- Facilitates predictive confidence in strain performance for downstream applications.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microbial systems for high-throughput screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for assay standardization.
- Enables parallel analysis of thousands of microcolonies, increasing statistical power.
- Supports scalable and reusable assay platforms for diverse genetic constructs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial system stability with translational biomarker strategies when relevant.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by quantifying genetic retention.
- Reduces risk of late-stage failure due to plasmid instability in engineered strains.
- Provides mechanistic insights for predictive de-risking in translational workflows.
Pipeline & Workflow Integration
This open-source microfluidic workflow integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling robust single-cell analytics from early target validation through assay development and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying plasmid retention at single-cell resolution.
- Screening: Delivers reproducible, high-throughput assay outputs for reliable compound or construct evaluation.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence-based measurements to compare genetic stability across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by ensuring engineered strain fidelity.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, open-source platform adaptable to various genetic and microbial systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in engineered strain validation.
- Operational Value: Standardizes and scales single-cell analysis with accessible instrumentation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust genetic stability data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial engineering projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, fluorescence microscopy, and microbial genetics.
- Needs open-source hardware for precise flow and temperature control.
- Demands cross-team standardization for reproducible data integration.
- Adaptable to various microbial models and genetic constructs with minimal modification.
- Limited by the need for fluorescence-based readouts and compatible imaging infrastructure.
