فصل وتجزئة بروتينات جدار الخلية وغشاء الخلية من المتفطرة السلية لتحليل البروتين النهائي

ركز بحثنا على تطوير طريقة مبسطة لفصل بروتينات جدار الخلية وغشاء الخلية غير القابلة للذوبان من المتفطرة السلية إلى أجزاء بسيطة للمقايسات البروتينية والمناعية المباشرة. يسمح التقدم في تقنيات الرحلان الكهربائي الآن بفصل البروتينات المعقدة إلى عدد أقل من كسور البروتين ، مما يسهل العزل الفعال القائم على المواصفات الجماعية للتطبيقات البروتينية والمناعية الوظيفية. تشمل التحديات الرئيسية ضعف قابلية الذوبان في البروتين الكارهة للماء الذي يترسب أكثر من مائة ملليغرام والتمسخ الناجم عن SDS-PAGE ، مما يعيق التطبيق النهائي الذي يحتاج إلى تأكيد أصلي مثل فحوصات نشاط الإنزيم.

لا يوجد بروتوكول حالي يفصل بشكل منهجي بروتينات جدار الخلية الكارهة للماء وغشاء الخلية إلى كسور محددة قابلة للذوبان في الماء للتحليل البروتيني والمناعي المباشر ، وهو أمر أساسي لفهم الوظيفة وتوجيه التدخلات. سيركز بحثنا المستقبلي على تطوير التشخيصات القائمة على مستضد الخلايا التائية وتقييم حساسيتها وخصوصيتها وأدائها عبر مجموعة مرضى السل من أجل الكشف المبكر والدقيق عن السل بهدف دعم مكافحة المرض بشكل أفضل. للبدء ، احصل على عينات جدار الخلية وغشاء الخلية والبروتين العصاري الخلوي من محللة الخلية الكاملة لعصيات المتفطرة السلية.

إذابة جدار الخلية وبروتينات غشاء الخلية في المخزن المؤقت للتركيز متساوي الكهرباء. أضف 2٪ أمفوليت بين نطاقات الأس الهيدروجيني من 3 إلى 10 ومن 4 إلى 6 بنسبة واحد إلى أربعة. الآن تجزئة البروتينات القابلة للذوبان في نظام تركيز سائل متساوي الكهرباء يتم الحفاظ عليه عند أربع درجات مئوية مع حمام مائي مبرد.

قم بإجراء فصل متساوي التركيز باتباع تعليمات الشركة المصنعة من خلال تطبيق طاقة ثابتة تبلغ 12 واط. اجمع الكسور الفردية متساوية التركيز باستخدام مضخة تفريغ. أوجد قيم الأس الهيدروجيني لكل كسر.

قم بإخضاع 50 ميكروغراما من الكسور المنفصلة إلى SDS-PAGE وتصور البروتينات باستخدام تلطيخ Coomassie Brilliant Blue أو الفضي. ابدأ بخلط جدار الخلية المنفصل عن IEF وكسور غشاء الخلية مع المخزن المؤقت لعينة الرحلان الكهربائي للهلام SDS. سخني الخليط على حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

افصل كسور البروتين في البعد الثاني ، باستخدام مواد هلامية بولي أكريلاميد مقاس 16 × 20 سم مع جل حل 12.5٪ وهلام تكديس 4٪. ثم استخدم عينة واحدة بطول 13 سم جيدا لتحميل العينة على الجل. قم بإجراء الرحلان الكهربائي بتيار ثابت يبلغ 50 مللي أمبير لكل هلام حتى تصل مقدمة الصبغة إلى قاع الجل.

بعد الرحلان الكهربائي ، قم بموازنة الجل في مخزن الشطف لمدة 10 دقائق. انقل الجل إلى جهاز جل كامل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للأداة. قم بتشغيل اللوتر بتيار ثابت يبلغ 250 مللي أمبير لمدة ساعة واحدة لإزالة البروتينات من الهلام، ثم استخدم مضخة تفريغ لجمع ما يقرب من 30 جزءا من البروتين، يبلغ قياس كل منها ثلاثة ملليلتر، من الهلام.

تحديد تركيز البروتين في الكسور الممسولة باستخدام مقايسة بروتين حمض البيسينشونيك. قم بإخضاع 10 ميكروغرام من أجزاء البروتين الممسوحة لتحليل SDS-PAGE وتصور النطاقات بواسطة تلطيخ Coomassie Brilliant Blue. لوحظت أنماط ربط البروتين المميزة في أول طاف: جدار الخلية ، وغشاء الخلية ، وكسور العصارة الخلوية من المتفطرة السلية ، مما يؤكد التجزئة تحت الخلوية الناجحة.

أظهر التركيز المتساوي لكهربية بروتينات جدار الخلية أعلى تركيز بروتين في الكسور ذات الرقم الهيدروجيني أقل من 2.5. كشفت SDS-PAGE لجدار الخلية عن كسور IEF عن نطاقات بروتينية مميزة ، في الغالب في الكسور من 1 إلى 8. كشف فصل بروتين غشاء الخلية بواسطة IEF عن قمم تركيز البروتين الرئيسية بين الرقم الهيدروجيني 4 ودرجة الحموضة 10 ، مع حدوث أعلى تركيز حول الرقم الهيدروجيني 10.

أظهرت SDS-PAGE لأجزاء IEF لغشاء الخلية ملامح بروتينية متنوعة مع نطاقات أكثر وضوحا في الكسور من 1 إلى 9. أنتج الفصل التحضيري SDS-PAGE لبروتينات جدار الخلية التي تم حلها بواسطة IEF كسولا في الغالب أقل من 100 ميكروغرام لكل مليلتر. عرضت SDS-PAGE لكسور بروتين جدار الخلية المملوءة مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية للبروتين ، مع نطاقات أكثر تركيزا في الكسور من 6 إلى 10.

كشفت SDS-PAGE التحضيرية لكسور بروتين غشاء الخلية أن أكثر من نصف الكسور تحتوي على تركيزات بروتين تتراوح بين 50 و 199 ميكروغراما لكل مليلتر. كشفت SDS-PAGE لأجزاء بروتين غشاء الخلية الممسوحة عن نطاقات مركزة في الممرات من 1 إلى 8 ومن 13 إلى 16.