الترتيب المضغوط مكانيا لأقسام اليرقات الزرد لتحليل النسخ المكاني
مايو 16, 2025
هنا ، نقدم طريقة لمحاذاة وتقطيع عينات يرقات متعددة من الزرد (Danio rerio) وجمعها على شريحة واحدة لتحليل النسخ المكاني.
في مختبر مورهاردت ، نستخدم سمك الزرد كنموذج حيواني لدراسة نمو المثانة ووظيفتها. لقد حددنا مثانة بولية وظيفية تملأ وتفرغ في الزرد. في حين أن أسماك الزرد صغيرة ، فقد سعينا للاستفادة من حجمها للاستفادة اقتصاديا من تقنيات النسخ المكاني وفهمنا لمثانة الفقاريات.
يمكن أن تصبح تقنيات النسخ المكاني باهظة الثمن بسرعة إذا لم يتم تحسين الكواشف والمعدات. يوفر هذا البروتوكول تقنية مثبتة لتحقيق ذلك باستخدام أسماك الزرد ويوفر رؤى حول النتائج المتوقعة والتخفيف من المشكلات التي قد تنشأ نتيجة للتكنولوجيا. إلى جانب الاستخدام الاقتصادي لتقنيات النسخ المكاني باهظة الثمن ، سمح لنا هذا العمل بإجراء تحليلات نسخية مكانية واسعة النطاق لأعضاء كاملة بشكل أساسي عبر عدة عصور مع تقليل تأثيرات الدفعات.
للبدء ، قم بتبريد ناظم البرد إلى 22 درجة مئوية واجمع كل العناصر المطلوبة. قم بإعداد قالب بلاستيكي يمكن التخلص منه لمحاذاة العينة. ضع قطعة من شريط المختبر داخل قالب القاعدة وارسم خطا مستقيما عبره بعلامة دائمة كنقطة مرجعية.
ضع علامة على الجزء الداخلي من قالب القاعدة لضمان اتجاه العينة المناسب أثناء التقطيع بالتبريد. بعد تحضير فوهة الزجاجة المتوسطة للتجميد ، قم بتوزيع الكمية اللازمة في أحد أركان القالب الأساسي. قم بإمالة القالب الأساسي ببطء لتوزيع الوسط بالتساوي.
الآن ، ضع القالب الأساسي بوسط تجميد في حمام جليدي واحتضنه لمدة 10 دقائق على الأقل لتبريد الوسط. بعد ذلك ، أضف جزءا واحدا من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى جزء واحد من الثلج الجاف في دلو ثلج تحت غطاء الدخان. ضع طبق أو قارب الألمنيوم القابل للتصرف في الحمام الجليدي وقم بتغطية الدلو لمدة خمس إلى 10 دقائق.
اجمع الأسماك الرحيم بعد غمرها في ماء أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. باستخدام ملقط ناعم الرؤوس ، أمسك الزعنفة الذيلية لإزالة السمكة واضغط عليها برفق على منديل ماص خال من النسالة لتجفيفه. ضع قالب القاعدة المحضر تحت مجهر استريو بتكبير 10x.
ضع العينة في القالب على طول النقطة المرجعية في الاتجاه الصحيح. قم بتغطية العينة برفق بطبقة رقيقة أخرى من وسط التجميد. استخدم نقطة مرجعية تشريحية لمحاذاة السمكة بدقة مع الخطوط المحددة داخل قالب القاعدة وضبط الاتجاه باستخدام ملقط رفيع الرؤوس ، وتجنب الفقاعات.
ضع قطعة من الثلج الجاف في قاع قالب القاعدة أسفل العينة حتى يتم تجميدها محليا في موضعها. حافظ على مستوى أفقي مستو لمنع اختلال محاذاة العينة قبل التجميد تماما. الآن ضع القالب الأساسي مع العينة على قارب أو طبق من الألومنيوم في حمام الثلج الجاف والإيثانول.
تأكد من بقاء القارب عائما على السطح وأن القالب الأساسي يظل جافا. غطي الحمام واتركي العينات تتجمد لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، لف القالب الأساسي المجمد بورق القصدير واحفظه في الفريزر على حرارة 80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للتقسيم.
أحضر قالب القاعدة المجمد إلى ناظم البرد المبرد مسبقا للتقطيع بالتبريد وضعه في حجرة ناظم البرد. بعد إزالة شريحة التصوير المكاني من التخزين ، ضعها في حامل شرائح مبرد مسبقا. قم بتخزين حامل الشريحة مع شريحة التصوير المكاني في حجرة ناظم التبريد 22 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا لتجميع القسم.
الآن ، قم بإزالة العينة المجمدة من القالب الأساسي وضعها في ظرف به وسط تجميد جديد ، مع التأكد من أن سطح القطع يواجه الشفرة الدقيقة. ثم ضع شفرة ميكروتومي دقيقة جديدة في ناظم البرد. بعد محاذاة القالب مع الشفرة ، قم بقص منطقة الاهتمام بسماكة موصى بها من 20 إلى 50 ميكرومتر.
تأكد من نقل العلامات داخل القالب إلى الكتلة المجمدة لتوجيه العينة بشكل صحيح. اضبط القالب أثناء التشذيب بحيث يظل سطح القطع موازيا للعلامات المرجعية في وسط التجميد. قم بتقطيع أقسام من الكتلة المجمدة واجمعها على شريحة مجهر قياسية موجبة الشحنة.
تحقق من الأقسام الموجودة أسفل مجهر المجال الساطع للتأكد من اكتمال التشذيب. ثم قم بإزالة شريحة التصوير المكاني من غرفة ناظم التبريد وضعها في حمام جليدي بأربع درجات مئوية ، مع الاحتفاظ بها داخل حامل الشريحة. ابدأ القطع بالتبريد بسماكة موصى بها من 10 إلى 14 ميكرومتر.
اجمع الأقسام على شرائح موجبة الشحنة حتى يتم الوصول إلى منطقة الاهتمام. الآن استرجع شريحة التصوير المكاني أحادية الخلية من الحمام الجليدي وقم بإزالة الشريحة من الحامل. اجمع المقاطع صفا تلو الآخر باستخدام فرشاة رسم دقيقة لمنع التدحرج.
ثم اضغط على زاوية من وسط التجميد الفارغ على مرحلة السكين باستخدام الجانب الخلفي من فرشاة الرسم. استخدم الجزء العلوي من الشريحة كنقطة محورية وقم بخفض الشريحة ببطء على القسم للسماح لها بالالتصاق لمدة ثلاث ثوان قبل رفعها. خطوط الأقسام التسلسلية المتوازية مع بعضها البعض لزيادة المساحة على الشريحة.
بعد جمع الأقسام من منطقة الاهتمام ، ضع الشريحة مرة أخرى في حامل الشريحة. إذا لم تكن هناك حاجة إلى مزيد من العينات ، فقم بتخزين الشريحة على حرارة 80 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين قبل التحليل. اجمع الأقسام قبل وبعد منطقة الاهتمام على شريحة مجهر قياسية موجبة الشحنة وقم بتلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين لتقييم محاذاة العينة وجودة القسم قبل متابعة التحليل.
تم التحقق من محاذاة الأقسام المتعددة من خلال مقارنة الهياكل عبر الأقسام في نفس القطع. مكنت التعديلات على خطوات التضمين والتجميع عددا أكبر من الأقسام من الاحتواء لمنطقة التصوير لشريحة النسخ المكاني. كانت جودة إشارة النسخ المكاني عالية داخل مناطق الأنسجة ولكنها أقل في مناطق الشرائح الفارغة بسبب انخفاض تعقيد الإشارة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة لمحاذاة وتقطيع عينة متعددة من يرقات الأسماك الزردية لتحليل النسخ المكاني. يهدف النهج إلى استخدام تقنيات النسخ المكاني بشكل اقتصادي مع تقليل تأثيرات الدفعة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء النمائي
- علم النسخ
الخلفية
- يتم استخدام الأسماك الزردية ككائن نموذج لدراسة تطور ووظيفة المثانة.
- تم التعرف على مثانة بولي وظيفية في الأسماك الزردية.
- يمكن أن تكون تقنيات النسخ المكاني مكلفة إذا لم يتم تحسينها.
- يهدف هذا البروتوكول إلى توفير رؤى حول النتائج المتوقعة وتخفيف المشاكل.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة فعالة من حيث التكلفة لتحليل النسخ المكاني باستخدام الأسماك الزردية.
- إجراء تحليلات واسعة النطاق للأعضاء الكاملة عبر أعمار مختلفة.
- تقليل تأثيرات الدفعة في دراسات النسخ.
الطرق المستخدمة
- محاذاة وتقطيع عينات يرقات الأسماك الزردية.
- جمع العينات على شريحة واحدة.
- تطبيق تقنيات النسخ المكاني.
- تحسين الكواشف والمعدات لكفاءة التكلفة.
النتائج الرئيسية
- محاذاة وتقطيع ناجح للعينات المتعددة.
- رؤى حول تطور المثانة من خلال تحليل النسخ.
- استخدام اقتصادي لتقنيات النسخ المكاني.
- تخفيف المشاكل المحتملة المرتبطة بالتكنولوجيا.
الاستنتاجات
- تسمح الطريقة بتحليل ناجح للنسخ المكاني في الأسماك الزردية.
- تدعم الدراسات واسعة النطاق مع تقليل التكاليف وتأثيرات الدفعة.
- يمكن أن يعزز هذا النهج فهم تطور المثانة في الفقاريات.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Spatial transcriptomic analysis in compactly arranged zebrafish sections enables high-throughput, cost-efficient mapping of gene expression across developmental stages. This approach reduces reagent and equipment costs while supporting robust, large-scale comparative studies with minimized batch effects. The method enhances early discovery and target validation by providing spatially resolved transcriptomic data in a genetically tractable vertebrate model.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially resolved interrogation of gene expression patterns in developmental models.
- Supports biological de-risking by clarifying tissue-specific transcriptomic changes.
- Facilitates predictive confidence in target selection through high-content spatial data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, spatially organized tissue sections for downstream transcriptomic workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization by minimizing batch effects across samples.
- Enables scalable, multiplexed analysis of multiple biological replicates on a single slide.
Translational & Preclinical Research
- Aligns developmental gene expression data with disease-relevant pathways in vertebrate models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by leveraging conserved genetic homology.
- Provides mechanistic insights that inform risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This spatial transcriptomic specimen arrangement method fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling efficient hypothesis testing and pathway analysis in vertebrate models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven mapping of gene expression in spatial context.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative spatial transcriptomic outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides high-content, spatially registered gene expression data for robust statistical evaluation.
- Translational Research: Bridges developmental biology findings to preclinical disease models via conserved pathways.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective workflow adaptable to multiple experimental conditions and replicates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and spatial transcriptomic workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient study designs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning, spatial transcriptomics, and zebrafish developmental biology.
- Needs access to spatial imaging platforms and analytical infrastructure for high-throughput data collection.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample alignment and sectioning protocols.
- Adaptable to other small vertebrate models with similar anatomical and genetic features.
- Section quality and alignment are critical for maximizing data output and minimizing signal loss.
