في الموقع عزل واستزراع بكتيريا التربة المتمردة باستخدام شريحة العزل (iChip)

توجد مستودعات غنية بالميكروبات في بيئات طبيعية متنوعة ، مثل التربة والمسطحات المائية والبيئات القاسية. ومع ذلك ، فإن الاستفادة من هذا التنوع البيولوجي الهائل محدودة إلى حد كبير بسبب الأساليب المختبرية والوسائط. من خلال اجتياز حاجز الثقافة هذا والاستفادة من هذا التنوع البيولوجي لديه القدرة على تلبية احتياجات التكنولوجيا الحيوية المختلفة ، فضلا عن حل التحديات العالمية.

فعلى سبيل المثال، أصبح تطوير المقاومة المضادة للميكروبات مناسبا للصحة العامة العالمية. قد تنتج بكتيريا التربة التي يصعب زراعتها في المختبر مركبات نشطة بيولوجيا جديدة ذات نشاط قوي مضاد للميكروبات يمكن أن تكون ذات قيمة في مواجهة التحدي العالمي للأنظمة المضادة للميكروبات. لم يتم استكشاف التنوع الهائل للميكروبات البيئية ومنتجاتها لأن التقنيات التقليدية القائمة على ثقافة المختبرات غالبا ما تؤدي إلى عزل ميكروبات معروفة مماثلة. الهدف من هذه التجربة هو إظهار ثقافة عالية الإنتاجية لبكتيريا التربة المتمردة في الموقع باستخدام تقنية IChip. في هذا البروتوكول ، سنوضح بناء واستخدام تقنية IChip هذه التي يمكن استخدامها للزراعة عالية الإنتاجية في الموقع للبكتيريا التي يصعب زراعتها واستعادة البكتيريا المنتجة للمضادات الميكروبات كتطبيق لهذه التقنية.

[مقدم العرض] للبدء ، قم بإنشاء تصميم أولي للألواح العلوية والسفلية والوسطى لشريحة العزل في برنامج العرض التقديمي. استخدم خيار إدراج الشكل في برنامج العرض التقديمي لإدراج دوائر ذات أبعاد الضرورة لتكون بمثابة IChip. أدخل دوائر أصغر بالداخل لتمثيل قنوات IChip. رتب الدوائر الأصغر في النمط المطلوب لإعداد تصميم أولي للوحة العلوية والسفلية والوسطى من IChip. حدد التصميم واستخدم قائمة النقر بزر الماوس الأيمن لحفظ التصميم الأولي كصورة. باستخدام التصميم الأولي كقالب ، ابدأ في إنشاء تصميم ثنائي الأبعاد باستخدام برنامج تصميم بمساعدة الكمبيوتر. من قائمة الرسم ، قم بإدراج أشكال محددة مسبقا ، في الغالب دوائر لإنشاء التصميم الأساسي للوحات IChip ومساحة القنوات. استخدم خيار البعد لتعيين الأبعاد الفعلية للوحات والقنوات. انقر فوق موافق لإنهاء التصميم ثم استخدم وظيفة البثق لتحويل التصميم ثنائي الأبعاد إلى نموذج ثلاثي الأبعاد بالسمك المطلوب. أخيرا ، استخدم قائمة الملفات لحفظ نسخة من النموذج ثلاثي الأبعاد بتنسيق ملف الطباعة الحجرية الثابت المتوافق مع الطباعة ثلاثية الأبعاد.

[مقدم العرض] اجمع جميع العناصر الأساسية المطلوبة لجمع عينات التربة والوصول إلى الموقع الذي سيتم جمع العينة منه. افتح تطبيق الترميز الجغرافي للهاتف المحمول وابحث عن العنوان الفريد المكون من ثلاث كلمات لموقع أخذ العينات وقم بتسجيله. بعد ذلك ، قم بتسجيل بيانات تعريف العينة ذات الصلة ، مثل درجة الحرارة والتاريخ والوقت وعمق أخذ العينات والطقس وتعرض الموقع للعناصر. رش مجرفة وصندوق البوليسترين الذي سيتم فيه زرع IChip بنسبة 70٪ من الإيثانول. امسحها بالمناديل الورقية واترك الإيثانول يجف تماما في الهواء. ثم استخدم المجرفة المطهرة لإزالة أي حطام سطحي ، مثل فضلات الأوراق أو الصخور لفضح التربة العلوية. تطهير المجرفة مرة أخرى كما كان من قبل. باستخدام المجرفة ، قم بالوصول إلى التربة على عمق ثلاثة إلى ستة ابتلاع تحت السطح ، وانقل حوالي أربعة إلى خمسة كجم من التربة من عمق موحد إلى صندوق البوليسترين. يجب أن يكون الصندوق ممتلئا بنسبة 75٪ تقريبا. انقل التربة المجمعة إلى المختبر على الفور. من عينة التربة التي تم جمعها ، قم بوزن جرام واحد من التربة الخالية من الحطام والصخور وفضلات الأوراق ، في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من المحلول الملحي المعقم. امزج التربة مع المحلول الملحي أثناء الدوامة لمدة 10 ثوان تقريبا لإنشاء ملاط التربة. اترك أنبوب الطرد المركزي دون إزعاج لمدة خمس دقائق للسماح لجزيئات التربة الكبيرة في الأنبوب بالاستقرار. ثم انقل معلق التربة الطافي بعناية إلى أنبوب اختبار جديد يسمى S. باستخدام تعليق التربة كعينة غير مخففة ، قم بإجراء تخفيف صفري عن طريق نقل مل واحد من العينة إلى تسعة مل من المحلول الملحي المعقم في أنبوب جديد. تحضير التخفيف من 10 هو القوة ناقص واحد إلى 10 هي القوة سالب خمسة. داخل خزانة السلامة الحيوية ، قم بتطهير السطح اللوحة العلوية واللوحة السفلية واللوحة الوسطى من IChip عن طريق نقع 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق. اشطف الإيثانول الزائد عن طريق غسل مكونات IChip بالماء المنزوع الأيونات المعقم ، واتركها تجف في الهواء طبق بتري معقم. ضع الطبق الأوسط من IChip في طبق بتري معقم جاهز للبذر. قم بإذابة وسيط أجار SMS في الميكروويف. اتركه ليبرد ، ثم انقل 22.5 مل من أجار SMS عند 45 درجة إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل. لهذا ، أضف 2.5 مل من التخفيف المناسب لعينة التربة واخلطها جيدا عن طريق الانعكاس اللطيف مع تجنب إدخال فقاعات الهواء. اسكب ببطء حوالي ثلاثة إلى أربعة مل من وسط أجار SMS المصنف على اللوحة الوسطى من IChip التي تغطي السطح بالكامل. ثم اترك وسيط أجار SMS يضبط لمدة خمس إلى 10 دقائق. تحقق مما إذا كان وسيط SMS agar قد تم تعيينه. ثم باستخدام شفرة الحلاقة المعقمة ، اكشط أجار SMS الزائد من سطح اللوحة المعدنية IChip تاركا وراءه سدادات الأجار في غرف الانتشار الفردية. بعد إزالة الصفيحة الواقية من أحد مرشحات غشاء البولي كربونات 0.03 ميكرومتر ، ضعها بعناية داخل الشفرة العلوية ل IChip باستخدام ملقط معقم. ثم ضع مرشحا غشائيا آخر من البولي كربونات 0.03 ميكرومتر على الجانب المكشوف من الصفيحة المعدنية المصنفة باستخدام ملقط معقم. ضع الألواح العلوية والسفلية ل IChip ، وقم بوضع اللوحة الوسطى ، وأغشية البولي كربونات ، مع الحرص على محاذاة فتحات المسامير هذه في جميع الألواح لإكمال تجميع IChip. اربط الصواميل والمسامير بإحكام لتأمين مجموعة IChip. قم بإنشاء منخفض أكبر من حجم IChip في مجمع التربة في صندوق البوليسترين باستخدام مجرفة معقمة. ازرع مجموعة IChip عموديا داخل المنخفض وقم بتعبئتها بالتربة بقوة لضمان تغطية جميع أسطح IChip بالكامل. ثم اسمح بالثقافة في الموقع لمدة المطلوبة من أسبوعين إلى أربعة أسابيع. أثناء الحضانة ، استخدم الماء المقطر المعقم لترطيب محيط التربة ، IChip المزروع ، بشكل دوري لمنع سدادات أجار SMS المصنفة في غرفة الانتشار من الجفاف. بعد الحضانة المرغوبة ، قم بإزاحة التربة برفق حول IChip المزروع لاستعادتها. ثم اغسل IChip بمحلول ملحي معقم لإزالة جزيئات التربة الملتصقة ونقلها داخل خزانة السلامة الحيوية لمزيد من المعالجة. قم بفك الصواميل والمسامير من مجموعة IChip وقم بتفكيك IChip بعناية. باستخدام ملقط معقم ، قم بإزالة أغشية البولي كربونات وانقل اللوحة الوسطى من IChip إلى طبق بتري المجهز. استخدم قضيب خشبي معقم لاستعادة سدادات الأجار الفردية داخل كل غرفة انتشار. قم بتلقيح سدادات الأجار في الوسائط المناسبة مثل أجار SMS أو 0.1X Tryptic Soy Broth Agar لمحاولة الزراعة المختبرية. يمكن بعد ذلك فحص العزلات المزروعة بحثا عن إنتاج مضادات الميكروبات بطرق روتينية ، مثل تراكب أجار باستخدام سلالات الاختبار. نعرض هنا نتائج الفحص التمثيلية ل 12 مزرعة ، IC-1 حتى 12 تم الحصول عليها من سدادات أجار IChip ضد المكورات العنقودية الذهبية ATCC 29213 و Acinetobacter baumannii B8342. لاحظ أن الثقافات IC-6 و IC-8 تظهر نشاطا ضد سلالات الاختبار إيجابية الجرام وسالبة الجرام على التوالي. بدلا من ذلك ، قم بتلطيخ وتصوير سدادات الأجار المستردة التي تحتوي على بكتيريا التربة المتمردة المزروعة في الموقع لتأكيد نمو المستعمرات الصغيرة في ظل ظروف الموقع. باستخدام هذا النهج ، من الممكن استعادة بكتيريا التربة المتمردة في الموقع بطريقة عالية الإنتاجية. يمكن أن يستوعب IChip المطبوع ثلاثي الأبعاد 156 قابس أجار. ومع ذلك ، من الضروري اختيار التخفيف الصحيح أثناء البذر لضمان زرع خلية بكتيرية واحدة في كل قناة من IChip. يمكن بعد ذلك فحص البكتيريا المطلوبة بحثا عن الأنشطة الحيوية المرغوبة ، مثل إنتاج المستقلب ، وإنتاج الإنزيم ، وإنتاج البوليمرات الحيوية ، وما إلى ذلك ، إذا كان من الممكن زراعتها في ظروف المختبر. ومع ذلك ، من المحتمل أيضا أن بعض البكتيريا قد لا تنمو في ظروف المختبر ، وفي مثل هذه الحالات ، قد نضطر إلى اعتماد مناهج ميتاجينومية لتحقيق الوجود الميكروبي والوصول إلى إمكاناتها الحيوية. الطريقة الموصوفة سهلة للغاية ويمكن استخدامها بسهولة للتنقيب البيولوجي عن الميكروبات في ظروف بيئية متنوعة مع تعديلات طفيفة.