التصوير المقطعي التسلسلي ثنائي الفوتون لدماغ القرمزية بالكامل للتحليلات التشريحية العصبية

التصوير المقطعي التسلسلي ثنائي الفوتون (STPT) هو تقنية لتصوير كتلة من الأنسجة في شكلها ثلاثي الأبعاد من خلال الجمع بين التصوير ثنائي الفوتون والتحكم التلقائي في المرحلة والتقطيع الدقيق. نصف هنا بروتوكولا لتنفيذه لأدمغة لفهم ميزاتها الهيكلية بشكل أفضل.

يستكشف بحثنا الأساس الهيكلي لوظائف الدماغ ، بما في ذلك وظائف البشر. باستخدام الشائع كنموذج ، نهدف إلى فهم دماغ الرئيسيات بشكل أفضل من خلال تحديد الروابط العصبية المشتركة عبر الأنواع وتلك التي هي فريدة من جنس الرئيسيات. أجرينا خريطة شاملة لإسقاطات الفص الجبهي لدماغ.

باستخدام تقنية التصوير المقطعي التسلسلي ثنائي الفوتون ، نجحنا في إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة للدماغ بأكمله ، والتي كشفت عن إسقاطات عمودية قوية بين مناطق الارتباط. يوفر التصوير المقطعي التسلسلي ثنائي الفوتون مجموعة بيانات لفهم الاتصال العصبي على مقياس الدماغ بأكمله. لا يساعد بروتوكولنا في تحسين معالجة أدمغة فحسب ، بل يقدم أيضا رؤى حول التعامل مع العينات الأخرى.

للبدء ، خذ دماغ المعزول والثابت واحتضانه بالكولاجيناز عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. باستخدام قطعة قطن ، افركي سطح الدماغ بعناية لتقشير الأم والسحايا الأخرى. استخدم ملقطا دقيقا لإزالة أي سحايا منفصلة متبقية.

لتحضير المخزن المؤقت لبوروهيدريد الصوديوم، قم بإذابة 0.2 جرام من بوروهيدريد الصوديوم في 100 مل من 50 ملليمول من البورات العازلة، الدافئة مسبقا إلى 40 درجة مئوية. تحضير الاغاروز المؤكسد عن طريق تقليب 2.25 جرام من الاغاروز و 0.21 جرام من بريدات الصوديوم في 100 مل من عازلة الفوسفات لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. قم بتصفية المحلول باستخدام شفط الفراغ واغسله بثلاثة تغييرات في عازلة الفوسفات.

ثم أعد تعليق الاغاروز في 50 مل من مخزن الفوسفات. بعد ذلك ، قم بإذابة الاغاروز تماما في فرن الميكروويف واتركه يبرد إلى 60 إلى 65 درجة مئوية. ضع الدماغ في غرفة مخصصة وقم بتضمين الدماغ في الاغاروز ، مما يضمن أن الاغاروز يملأ التجويف أسفل الجسم الثفني.

بعد تصلب هلام الاغاروز ، قم بتفكيك الغرفة واغمر كتلة الاغاروز في محلول بوروهيدريد الصوديوم طوال الليل عند أربع درجات مئوية. الآن ، باستخدام مزيج فوري من الإيبوكسي ، قم ببناء مرحلة زجاجية منزلقة عن طريق إرفاق أربعة مغناطيسات نيوديميوم. قم بتركيب كتلة الاغاروز على المسرح باستخدام مادة لاصقة قوية.

قم بتشغيل نظام تصوير الأنسجة بالكامل باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بمعالجة دماغ بأكمله من الأمام إلى الأطراف الخلفية. بعد ذلك ، اضبط زوايا الشفرة للتأكد من أن أعماق السطح عند كلا الطرفين في حدود 10 ميكرومتر.

للقيام بذلك ، ابحث عن السطح العلوي عن طريق تغيير موضع الهدف ، باستخدام وحدة التحكم بيزو. اضبط مستوى التصوير على حوالي 25 إلى 35 ميكرومتر من السطح للتعويض عن تكوين الميالين الكثيف وضمان اختراق ليزر موحد. باستخدام شفرة خزفية ، قم بتقطيع الدماغ بالكامل إلى فترات 50 ميكرومتر ، مما ينتج عنه ما يقرب من 650 شريحة.