خلايا القمة العصبية القحفية ثلاثية الأبعاد في بروتوكول التمايز في المختبر للفحص متعدد الإرسال

نحن مهتمون بفهم كيفية تنظيم قرار معين أثناء التطوير. تسمح لنا النماذج العضوية وتقنيات الخلية المفردة بطرح أسئلة لم تكن ممكنة من قبل. يسمح لنا استخدام النماذج العضوية في المختبر بتوليد كمية أكبر من البيانات ، خاصة بالنسبة لمجموعات الخلايا العابرة ، مثل القمة العصبية.

لا تزال مخرجات نموذج التباين الكبير تمثل تحديا تجريبيا كبيرا. لقد أثبتنا أن خلايا قمة الجمجمة تعيد التعبير عن جينات الفاعلية لتوسيع إمكانات التمايز. للبدء ، قم بإعداد محلول كولاجيناز طازج بتركيز ملليغرامين لكل مليلتر في وسط خروج المغلوب DMEM.

استنشق وسط ESC من صفيحة البئر التي تحتوي على 70 إلى 80٪ mESC ملتق. الآن ، أضف برفق ملليلتر واحد من PBS إلى جانب البئر. هز اللوحة لضمان الغسيل المتساوي.

ماصة من PBS واستبدلها بملليلترين من محلول الكولاجيناز. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة. افحص اللوحة تحت المجهر الضوئي بتكبير 10 أضعاف بعد 20 دقيقة من الحضانة ، ثم كل خمس دقائق.

عندما تظهر المستعمرات حوافا ملفوفة ، انقر بقوة على جانب اللوحة لفصل المستعمرات. باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر ، اجمع المستعمرات المنفصلة وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. الطرد المركزي للمستعمرات عند 16 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.

استنشق أكبر قدر ممكن من الوسط من الأنبوب المخروطي دون إزعاج المستعمرات في الأسفل. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من محلول التربسين 0.05٪ إلى الحبيبات واحتضنها. باستخدام الماصات الدقيقة P1000 و P200 ، قم بتحريك المعلق لأعلى ولأسفل بقوة لفصل المستعمرات ، ثم أضف ملليلترين من وسط استزراع mESC لمنع التربسين.

جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 160 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. ماصة من المادة الطافية ، ثم أضف ملليلترا واحدا من وسط التمايز CNCC. عد الخلايا بجهاز عد الخلايا الآلي أو تحت المجهر ، ثم قم بتخفيف الخلايا في وسط تمايز CNCC لتحقيق تركيز 3 ، 000 خلية حية لكل 50 ميكرولترا.

باستخدام ماصة دقيقة P200 ، قم بزرع 50 ميكرولترا من تعليق الخلية في كل بئر من صفيحة 96 بئر ذات قاع U غير TC. قم بتعبئة كل بئر حتى 200 ميكرولتر باستخدام وسيط التمايز CNCC واحتضانه. راقب اللوحة التي تحتوي على ثقافة 24 ساعة للخلايا المتمايزة تحت المجهر الضوئي للتأكد من ظهور مجموعات صغيرة ذات حدود واضحة في قاع كل بئر.

ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة طوال الليل. في اليوم الثاني ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط ببطء من كل بئر. بعد ذلك ، استخدم ماصة دقيقة P200 مع قطع طرفها من ثلاثة إلى أربعة ملليمترات من النهاية لشفط المجالات العصبية مع الوسط المتبقي.

انقل المجالات العصبية والوسط المتبقي إلى صفيحة مسطحة القاع 96 بئرا غير معالجة. تحقق من النقل تحت المجهر الضوئي. ضع فوق كل بئر 200 ميكرولتر من وسط التمايز CNCC الدافئ مسبقا.

في اليوم الرابع ، استنشق 100 ميكرولتر من الوسط من كل بئر. استبدله ب 100 ميكرولتر من وسط التمايز CNCC المسخن مسبقا ، ثم احتضنه مرة أخرى. في اليومين الخامس والسادس، تحقق من ارتباط الغلاف العصبي تحت المجهر الضوئي.

تأكد من أن الخلايا الأخف وزنا التي تتلاشى من المجالات العصبية تبدأ في إحاطة جسمها الرئيسي. قم بإعداد وسيط صيانة CNCC حسب التركيبة المقدمة. قم بتصفية ألبومين مصل الأبقار من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر قبل إضافته إلى الوسط.

بمجرد إضافة عوامل النمو ، قم بتخزين الوسط عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع ، مع ضمان حمايته من الضوء. أضف 100 ميكرولتر من محلول الفبرونيكتين في كل بئر من صفيحة 96 بئرا غير معالجة. أثناء استراحة اللوحة ، استنشق أكبر قدر ممكن من وسط التمايز CNCC من آبار الصفيحة المسطحة ذات القاع غير TC ذات القاع المسطح المكون من 96 بئر.

استبدل الوسط ب 50 ميكرولتر من Accutase. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من وسيط صيانة CNCC في كل بئر لإخماد Accutase.

قم بإزالة الفيبرونيكتين من الآبار المطلية بلوحة الاستقبال. ثم قم بتصفية CNCC المنفصل بعد الهجرة من خلال مرشح 40 ميكرومتر في آبار لوحة الاستقبال. في النقطة الزمنية المطلوبة ، استخدم ماصة دقيقة مقطوعة P200 لنقل المجالات العصبية من الصفيحة المكونة من 96 بئرا إلى أنبوب منخفض ربط الحمض النووي بحجم ملليلتر.

بعد ترك المجالات العصبية تستقر في الأنبوب لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بإخراج أكبر قدر ممكن من الوسط ، ثم اشطفها بمليلتر واحد من PBS البارد. لتحضير غرف التثبيت ، ضع ثلاث طبقات من الشريط الشفاف الخالي من الألياف على الوجهين على شريحة مجهرية. باستخدام ماكينة حلاقة ، قم بقص نافذة ثلاثة ملليمترات في ثمانية ملليمترات في الشريط على الوجهين.

تحت مجسم ، مع طرف مقطوع P200 ، قم بسحب الماصة بعناية للمجالات العصبية في عامل المقاصة في غرفة التركيب. استخدم التكبيرات بين 2X و 4X لتوفير مجال رؤية للغرفة بأكملها وتحديد المجالات العصبية. ضع زلة غطاء على سطح الغرفة واضغط برفق على جوانبها للالتصاق بها.

أظهرت ثقافات الغلاف العصبي في الصفائح غير الأنسجية مرفقات موحدة بدءا من اليوم الخامس ، بينما أظهرت مزارع أطباق بتري ارتباطا متغيرا واندماجا للمجالات العصبية ، وهو ما يتضح بشكل خاص في اليوم الرابع. تم تقليل تباين حجم المجالات العصبية بشكل كبير في مزارع الألواح المكونة من 96 بئرا مقارنة بمزارع أطباق بتري في اليومين الرابع والسابع. تراوح قطر المجالات العصبية في صفائح 96 بئرا من 139 ميكرومتر إلى 295 ميكرومتر في اليوم الرابع و 383 ميكرومتر إلى 552 ميكرومتر في اليوم السابع ، بينما أظهرت مزارع أطباق بتري نطاقا أوسع.

كان نمو الغلاف العصبي أسيا من حيث أعداد الخلايا ، حيث ارتفع من متوسط 1،082 خلية في اليوم الثاني إلى 48،352 خلية في اليوم التاسع. كان نمو القطر خطيا ، حيث ارتفع من متوسط 136 ميكرومتر في اليوم الثاني إلى 570 ميكرومتر في اليوم التاسع. أكد تحليل التألق المناعي أن المجالات العصبية والخلايا المزيلة تعبر عن علامات CNCC AP2 alpha و SOX9 و EMT marker TWIST1 في اليومين التاسع و 13.

كان PAX7 موجودا فقط في المجالات العصبية.