توصيف الحويصلات خارج الخلية من السوائل البيولوجية
فبراير 28, 2025
هنا ، نوضح طريقة توصيف الحويصلات خارج الخلية (EVs) التي تم جمعها من السوائل البيولوجية ، مثل الدموع واللعاب ، للبشر. الماسح الضوئي المستخدم في هذه الطريقة قادر على اكتشاف النمط الظاهري والحجم والعدد الكلي للجسيمات للمركبات الكهربائية من 1 ميكرولتر من العينة.
الحويصلات خارج الخلية كمؤشرات حيوية للمرض ، تعكس الحالات الفسيولوجية. يتيح نهجنا استخراج البيانات الغنية من أحجام الدموع الصغيرة ، مما يعزز أبحاث المركبات الكهربائية في السوائل البيولوجية. تشمل التحديات التجريبية الرئيسية الحصول على تركيزات كافية من الحويصلة خارج الخلية من عينات صغيرة ، وتقليل فقدان العينة أثناء العزل ، وتحسين التحليل لمنع تشبع الرقاقة أو اكتشاف الإشارة الضعيفة.
يتجاوز هذا البروتوكول خطوات العزل ، مما يقلل من وقت المعالجة ، ويسمح بتحليل الحويصلات خارج الخلية من أحجام العينات الثانوية ، مما يجعله مثاليا للعينات البيولوجية المحدودة ، مثل الدموع. تعتبر المؤشرات الحيوية غير الغازية ضرورية للكشف المبكر عن اضطرابات القرنية وإدارتها. تتيح المؤشرات الحيوية للحويصلات خارج الخلية مراقبة المرض والعلاجات الشخصية وامتثال المريض بشكل أفضل وتحسين نوعية الحياة.
كانمختبرنا رائدا في تحليل الحويصلات خارج الخلية في عينات المسيل للدموع من أشخاص KC ، وتحديد توقيعات tEV الفريدة. هذا يمهد الطريق للتشخيص المستقبلي والأهداف العلاجية التي تركز على المركبات الكهربائية. للبدء ، حدد العينات البيولوجية وشريحة رباعي السبانين على مساحة العمل.
ماصة 70 ميكرولترا من العينات البيولوجية البشرية التي تم خلطها مسبقا مع المحلول B من مجموعة رباعي السبانين البشرية على شريحة. ضع الفيلم على لوح غسيل رقائق لمنع تبخر العينة. بعد 16 ساعة ، ضع اللوحة في غسالة الرقائق.
أغلقه في مكانه وأغلق الغطاء. اضغط على خيار CW-TETRA v0 في غسالة الرقائق. أثناء غسل الرقائق ، قم بإعداد 300 ميكرولتر من محلول الحجب لكل شريحة.
أضف 0.6 ميكرولتر من كل جسم مضاد لكل شريحة إلى محلول الحظر. قم بتدوير محلول الحجب باستخدام كوكتيل الأجسام المضادة لضمان الخلط الشامل. عند اكتمال غسل الرقائق ، أضف 250 ميكرولترا من محلول الحجب مع كوكتيل الجسم المضاد فوق كل شريحة.
ثم أغلق الغطاء واضغط على متابعة. عندما تغرد غسالة الرقائق ، قم بإزالة لوحة غسيل الرقائق. حرك الرقائق لأعلى المنحدر.
ضع اللوحة مرة أخرى في غسالة الرقائق ، مع التأكد من تثبيتها بإحكام في مكانها. أغلق الغطاء واضغط على متابعة. للبدء ، قم بتشغيل محلل الجسيمات النانوية.
قم بتشغيل برنامج المسح الضوئي على سطح المكتب المتصل بمحلل الجسيمات النانوية. حدد مجلد الشريحة لاختيار كل شريحة tetraspanin وتحديد موقعها في Chip Position على الظرف. انقر فوق المربعات الثلاثة أسفل موضع الرقاقة لتشغيل التألق.
ستتحول المربعات إلى اللون الأصفر والأزرق والأحمر. اضغط على غطاء الظرف واسحبه لإزالته. ثم قم بتأمين رقائق التتراسبانين المحملة بالعينة بإحكام على الظرف.
قم بمحاذاة أوتاد غطاء الظرف مع الثقوب واضغط لأسفل. حرك الغطاء لتثبيته في مكانه. ثم ضع الظرف على المسرح وأغلقه في مكانه.
بعد ذلك ، انقر فوق Scan Chips من واجهة البرنامج ، ثم انقر فوق موافق. بمجرد أن تنتقل المرحلة بالكامل إلى الجهاز ، أغلق الباب. عند اكتمال الفحص ، افتح الباب لإخراج المرحلة والتحقق من النتائج. إذا نجحت عمليات الفحص ، فتخلص من الرقائق.
ضع المجموعة التالية من الرقائق على الظرف. بدلا من ذلك ، أعد ظرف الظرف الفارغ إلى المسرح. اخرج من البرنامج وقم بإيقاف تشغيل الجهاز عند الانتهاء.
لوحظت مستويات التألق المثلى للحويصلات خارج الخلية في قنوات CD63 و CD81 و CD9 ، بينما ظلت قناة التحكم MIgG سوداء ، مما يؤكد خصوصية التحكم. تم تقليل CD81 للسوائل البيولوجية. لا يوجد مضان في قنوات CD63 و CD81 و CD9 يدل على عدم وجود حويصلات خارج الخلية.
كان التشبع المفرط في التألق واضحا ، مما يجعل من الصعب تمييز البيانات ذات المغزى بسبب الملصقات المفرطة ، لا سيما في قنوات CD63 و CD81 و CD9.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة لتمييز الحويصلات خارج الخلية (EVs) المجمعة من السوائل البيولوجية البشرية، مثل الدموع واللعاب. من خلال استخدام رقاقة تتراسبانية، تسهل الطريقة تحليل الحويصلات خارج الخلية من أحجام عينات قليلة، مما يتقدم دراسة المؤشرات الحيوية غير الغازية لمراقبة الأمراض.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- الحويصلات خارج الخلية
- المؤشرات الحيوية غير الغازية
- الأمراض العينية
الخلفية
- تعمل EVs كمؤشرات للحالات الفسيولوجية والمرضية
- تشمل التحديات التركيزات المنخفضة في العينات الصغيرة ووقت معالجة العينة
- أهمية الكشف المبكر عن اضطرابات القرنية
الطرق المستخدمة
- استخدام رقاقة تتراسبانية لتحليل EV
- عينات بيولوجية بشرية (دموع)
- كشف مبني على الفلورسنت لعلامات EV CD63، CD81، وCD9
النتائج الرئيسية
- إندماج خطوات تحضير العينة والتحليل يقلل من وقت المعالجة
- مستويات الفلورسنت لعلامات EV أكدت الخصوصية والوجود
- تحديد تواقيع tEV في عينات الدموع من الأفراد المصابين بالقرنيّة المخروطية
الاستنتاجات
- توفر هذه الطريقة نهجًا مبسطًا لتحليل EV من عينات بيولوجية صغيرة
- تدعم النتائج التشخيصات المستقبلية والأهداف العلاجية في صحة العين
الأسئلة المتكررة
Executive Industry Relevance
Characterizing extracellular vesicles (EVs) from minimal biological fluid volumes addresses a critical bottleneck in non-invasive biomarker discovery and disease monitoring. This workflow enables high-content EV phenotyping from scarce patient samples, supporting translational research and early-stage target validation. The approach enhances predictive confidence for biomarker-driven portfolio decisions in ocular and systemic disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EV-based biomarkers for disease-relevant pathway analysis.
- Supports functional target validation by quantifying EV phenotypes from patient-derived fluids.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking EV signatures to physiological states.
Screening & Assay Development
- Prepares validated EV detection systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible EV marker measurements from as little as 1 μL of sample.
- Standardizes assay conditions to minimize sample loss and maximize data quality.
Translational & Preclinical Research
- Aligns non-invasive EV biomarker analysis with disease monitoring strategies.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation using patient-derived fluids.
- Supports risk-adjusted advancement of biomarker-driven therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This EV characterization protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early biomarker identification with translational validation in limited-sample contexts.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing for EV biomarker relevance in disease states.
- Screening: Offers reproducible, quantitative EV marker readouts for assay development.
- Analytics: Delivers particle count, size, and phenotype data to compare biological conditions.
- Translational Research: Connects non-invasive sample analysis to preclinical biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable platform for EV analysis across diverse biological fluids.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV biomarker discovery and target validation.
- Operational Value: Reduces sample requirements and processing time while enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for biomarker-driven programs and reduces late-stage risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of non-invasive biomarker assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EV biology and fluorescence-based detection systems.
- Needs access to nanoparticle analyzers and tetraspanin chip technology.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data interpretation.
- Adaptable to various biological fluids with protocol optimization.
- Potential limitations include chip oversaturation and signal detection thresholds.
