تصور الديناميكيات الميكروبية لتدوير الميثان في الأراضي الرطبة الساحلية

تطابقت هذه الدراسة بصريا مع التوزيع المكاني والزماني للجينات الميكروبية الرئيسية لتدوير الميثان في الأراضي الرطبة الساحلية في جنوب تكساس ، وتستكشف كيف تنظم العوامل البيئية ديناميكيات الميثان. تكشف النتائج التي توصلنا إليها أن وفرة جينات دورة الميثان في الأراضي الرطبة الساحلية في جنوب تكساس حساسة للظروف البيئية ، بما في ذلك الملوحة والموسم. على وجه الخصوص mmoX ، وهو نوع من جين الميثان أحادي الأكسجين ، يكون أكثر وفرة في المواسم الباردة.

يتناول هذا البروتوكول البحث في الكشف عن الجينات الميكروبية لدورة الميثان من خلال تقديم أدوات جديدة لتصور الديناميكيات الميكروبية المكانية والموسمية المتأثرة بالعوامل البيئية. من خلال دمج طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل المحسنة مع تصور نظم المعلومات الجغرافية ، يوفر هذا البروتوكول اكتشافا محسنا ورسم خرائط مكانية لجينات دورة الميثان مع التقاط الأنماط الميكروبية الديناميكية والمكانية والموسمية المتأثرة بالعوامل البيئية.

[الراوي] للبدء ، قم بإعداد خليط تفاعل cPCR سعة 25 ميكرولتر مع eDNA والمكونات الأخرى. ضع الأنابيب في جهاز PCR وقم بتشغيل تفاعل cPCR مع المعلمات المناسبة. بعد cPCR ، قم بإعداد خليط تفاعل qPCR الذي يحتوي على اللون الأخضر السيبراني ، باستثناء الحمض النووي للقالب. قم بتوزيع 57 ميكرولترا من خليط التفاعل المحضر في كل أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). أضف 3 ميكرولترات من قالب الحمض النووي أو الماء القياسي أو الخالي من النوكلياز إلى كل أنبوب واضغط على الأنبوب برفق للخلط. Aliquot 20 ميكرولترا من خليط التفاعل المحضر من كل أنبوب في آبار مخصصة للوحة qPCR 96 بئرا. أغلق لوحة PCR بغشاء مانع للتسرب لاصق PCR باستخدام قضيب. وقم بالطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة دقيقة واحدة لضمان الخلط المناسب ، والقضاء على أي فقاعات داخل الآبار. ضع لوحة PCR في جهاز التدوير الحراري. قم بتشغيل جهاز qPCR وافتح البرنامج ذي الصلة لإعداد البروتوكول. قم بإعداد برنامج qPCR وابدأ التشغيل. افتح برنامج نظام المعلومات الجغرافية، ArcGIS Pro، واحفظ ملف المشروع باسم منطقة الدراسة في المجلد المحدد على الكمبيوتر. انقر فوق الخريطة ، ثم حدد خريطة الأساس ، واختر التضاريس ذات التسميات كخريطة أساسية. انقر فوق تحديد موقع ، ثم انقر فوق بحث. عند فتح شريط البحث، اكتب اسم منطقة الدراسة لتحديد موقعها على الخريطة. لرسم المنطقة المحددة باستخدام الإسناد الجغرافي ، انقر فوق عرض ، ثم جزء الكتالوج من الطبقة العليا. انقر نقرا مزدوجا فوق المجلد من الكتالوج وحدد اسم الملف المطلوب. انقر بزر الماوس الأيمن فوق ملف .gdb لقاعدة البيانات الجغرافية. انقر فوق جديد وحدد فئة الميزة. ثم ستظهر نافذة إنشاء فئة الميزة. اكتب مربع الاسم والاسم المستعار وانقر فوق إنهاء في الأسفل. الآن ، انقر فوق عرض ، متبوعا بالمحتويات. سيظهر اسم الاسم المستعار في جزء المحتويات. انقر فوق تحرير من الطبقة العليا ، متبوعا ب إنشاء. سيتم فتح جزء إنشاء الميزات. انقر نقرا مزدوجا فوق الاسم المستعار في جزء إنشاء الميزات وستظهر خيارات تكوين ملاحظات الأداة. حدد خطوط، ثم ارسم خطوطا على الخريطة لإنشاء حدود منطقة الدراسة. انقر نقرا مزدوجا فوق الخريطة للإنهاء. تصغير برنامج GIS وافتح جدول بيانات. اكتب اسم العينة في العمود الأول وخط العرض في العمود الثاني وخط الطول في العمود الثالث. استخدم الأعمدة الأربعة التالية لبيانات qPCR ل pmoA1 و pmoA2 و mmoX و mcrA. احفظ الملف بتنسيق CSV في مجلد معين على الكمبيوتر. بعد ذلك ، افتح برنامج GIS وانقر فوق إضافة بيانات ، متبوعا ببيانات XY نقطة. حدد ملف CSV المحفوظ من المجلد الموجود في مربع جدول الإدخال. أعد تسمية الملف في المربع فئة ميزة الإخراج، وانقر فوق تشغيل لعرض نقاط أخذ العينات على الخريطة. الآن ، انقر فوق شريط البحث في الأعلى وابحث في Kriging. حدد ملف محطة أخذ العينات واختر pmoA1. ثم انقر فوق البيئة ، وحدد محطة أخذ العينات في الطبقة والقناع ، وانقر فوق تشغيل. لإنشاء تخطيط للخريطة، انقر فوق إدراج وتخطيط جديد، وحدد ANSI-Landscape. انقر فوق إطار الخريطة ، وحدد الخريطة باستخدام kriging ، وضع جميع الخرائط في التخطيط عن طريق رسم المستطيلات. حدد السهم الشمالي وضعه في التخطيط للإشارة إلى الاتجاه الشمالي. ثم حدد شريط المقياس لعرض مقياس المنطقة على الخريطة. انقر فوق وسيلة الإيضاح ، ثم ضعها في التخطيط لعرض أساطير الخريطة. انقر فوق الشبكة ، ثم حدد أي خيار graticule أسود لإنشاء شبكة بخطوط الطول والعرض. ستظهر الشبكة في جزء المحتويات مع التسمية Black Horizontal Label Graticule. انقر نقرا مزدوجا فوق Black Horizontal Label Graticule ، وحدد المكونات ، وقم بإزالة Ticks 1 و Grid بالنقر فوق علامة الصليب الموجودة على يمينهما. أخيرا ، انقر فوق مشاركة من الطبقة العليا ، ثم انقر فوق تصدير التخطيط. حدد نوع الملف كملف PDF، واحفظ الملف على الكمبيوتر باستخدام المربع Name، واضبط الدقة الرأسية على 500 نقطة في البوصة، وانقر فوق Export لإنشاء ملف PDF للخريطة. كشف تحليل cPCR عن التباين المكاني في الكشف عن الجينات المرتبطة بدورة الميثان ، مع اكتشاف جينات mcrA في جميع عينات LB و RV ، ولكنها غائبة في عينات BC ، مما يربط الملوحة بتوزيع الميثانوجين. أظهر cPCR نطاقات أكثر إشراقا ل pmoA1 مع أزواج التمهيدي A189-mb661 ، مما يؤكد وفرة منخفضة ولكن يمكن اكتشافها في عينات RV ، بينما كانت غائبة في LB و BC. أظهر تحليل qPCR تباينا موسميا عاليا ، حيث تكون جينات mmoX أكثر وفرة خلال الموسم البارد و pmoA1 أكثر وفرة خلال الموسم الدافئ.