تصوير إشارات Ca²⁺ في الأوردة الرئوية الصغيرة عند الضغوط الفسيولوجية داخل اللمعة

في هذا البروتوكول ، نقدم تقنية جديدة لتسجيل وتحليل إشارات Ca²⁺ في الأوردة الرئوية (الأوردة الرئوية الصغيرة أو PVs) عند الضغوط الفسيولوجية داخل اللمعة. تتضمن هذه التقنية عزل الكهروضوئية الصغيرة ، واحتضانها بمؤشر Ca²⁺ ، وتحريكها وضغطها ، والتصوير متحد البؤر لإشارات Ca^{2 +} ، وتحليل البيانات.

تنظم إشارات الكالسيوم وظيفة الأوعية الدموية ، وتختلف في المصدر والدور. نهدف إلى فهم وظائفها المحددة في جدار الأوعية الدموية وتحديد التشوهات المرتبطة بالمرض. تركز معظم دراسات الأوعية الدموية الرئوية على الشرايين أو الشعيرات الدموية ، وليس الأوردة الرئوية.

لم تفحص أي دراسات إشارات الكالسيوم في الأوردة الرئوية تحت ضغوط طبيعية داخل اللمعة على الرغم من أهميتها الفسيولوجية. تخضع الأوردة الرئوية لتغير الضغط أثناء دورات القلب ، لكن تأثيرها على إشارات الكالسيوم لم يكن مدروسا. يتيح بروتوكولنا الحصول على إشارات الكالسيوم والتحليل التلقائي لها في الأوردة الرئوية الصغيرة عند الضغط الطبيعي.

يتيح بروتوكولنا إجراء دراسات مستقبلية حول كيفية تأثير الضغط داخل اللمعة على إشارات الكالسيوم في الأوردة الرئوية الصغيرة ، مما يعزز فهم تنظيمها ودورها في الصحة والمرض. للبدء ، قم بتنظيف أدوات التشريح والأطباق في 100٪ من الإيثانول ، ثم اغسلها بالماء منزوع الأيونات. مع زوج من المقص.

افتح التجويف الصدري للفأر القتل الرحيم. استخدم الملقط لإزالة القلب والرئتين بعناية من التجويف الصدري بأقل قدر من لمس الرئتين. بعد ذلك ، ضع الأنسجة على صفيحة مطلية بواقي مانع للتسرب تحتوي على محلول ملح فسيولوجي بارد مخزن HEPES.

قم بتثبيت القلب والرئتين باستخدام دبابيس التشريح بحيث تكون الأوردة الرئوية الكبيرة والشرايين الرئوية مرئية بوضوح ، ويتم شد الفص الأيسر للرئة قليلا. باستخدام الأوردة الرئوية الكبيرة كنقاط مرجعية ، قم بإزالة الأنسجة المحيطة بالأوردة الرئوية الصغيرة بعناية بمساعدة مقص ناعم. ثم اعزل الأوردة الرئوية الصغيرة برفق عن الأنسجة المحيطة.

بعد ذلك ، قم بإعداد تركيز مخزون 2.5 ملليمولار Fluo-4 AM مع DMSO. باستخدام محلول المخزون ، قم بإعداد محلول التحميل. ضع الأوردة الرئوية الصغيرة في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر مع محلول التحميل.

قم بتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم المحتضن في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. لتقنب الأوردة الرئوية الصغيرة ، قم بإزالة الوريد من محلول الغسيل. ضعه في غرفة تصوير عضلي الضغط المعدة.

باستخدام زوج من الملقط ذو الرؤوس الدقيقة ، قم بتقطيع أحد طرفي الوريد الرئوي الصغير بعناية على إحدى القنيات ، ثم استخدم خيوطا دقيقة من خيط النايلون لربط عقدة حول الطرف المقنئ للوريد الرئوي الصغير وطرف القنية لتثبيتها. ادفع محلول الملح الفسيولوجي برفق عبر القنية لإزالة الدم داخل الوريد الرئوي. استخدم خيط النايلون لربط الطرف الآخر بقنية زجاجية باستخدام خيوط دقيقة.

لتصوير الكالسيوم ، قم أولا بتوصيل جهاز تحكم في الضغط المؤازر بأنبوب يحتوي على محلول ملح فسيولوجي مخزن HEPES. استخدم وحدة التحكم للضغط على الوريد الرئوي الصغير من أحد طرفيها. الآن قم بتوصيل مضخة تمعجية بمدخل ومخرج ومخرج وقم بتصهر المحلول.

بعد فترة التوازن ، استخدم هدف غمس الماء 40x ونظام التصوير متحد البؤر للقرص الدوار للحصول على صور الكالسيوم ل 1,000 إطار. لإجراء تحليل الصور ، قم بتشغيل Spark والبرامج المصممة خصيصا. استخدم مرشح خمسة في خمسة ومرشح الوسيط لتنعيم الصور ، متبوعا بإطار يحدد منطقة مسطحة من الوريد الرئوي مع خلايا متعددة للكشف التلقائي للأحداث.

انقر فوق العرض والكشف التلقائي عن الأحداث. اضبط عتبة الحدث عند سعة 1.3F على F0، والتسامح إلى 20٪مربع المسح الضوئي إلى سبعة × سبعة بكسل، ومتوسط التشغيل إلى سبع صور. انقر فوق بدء البحث أو أيقونة العين.

ابحث عن جدول الأحداث بالنقر فوق جدول الأحداث الصغيرة أسفل قائمة العرض ، ثم احسب الأحداث لكل ميكرومتر مربع بقسمة عدد إشارات أيونات الكالسيوم المكتشفة على مساحة الإطار المحدد. كان عدد إشارات الكالسيوم التي تحدث تلقائيا في الأوردة الرئوية الصغيرة عند خمسة ملليمترات من الضغط داخل اللمعة الزئبق 0.73 زائد أو ناقص 0.2 حدثا في الدقيقة لكل ميكرومتر مربع في الظروف القاعدية. أدت إضافة الريانودين إلى تقليل نشاط إشارات الكالسيوم بشكل كبير.