تنقية الشبكة الإندوبلازمية ساركو Ca^{2 +} -ATPase من عضلة الأرانب

يركز بحثنا على تنقية SERCA ، بجودة هيكلية عالية ونشاط تحفيزي أثناء التحقيق فيما إذا كان التريهالوز يثبت SERCA أثناء التنقية ، مما يعزز استقراره ووظائفه. تحديد الهيكل ثلاثي الأبعاد ل ATPases من النوع P في حالاتها قليلة القلة. استخدام الذكاء الاصطناعي للنمذجة الهيكلية ل ATPases ، ومحاكاة الديناميكيات الهيكلية ، والالتحام الجزيئي للروابط لاستكشاف علاجات الأمراض وتحسين تحليل وظائف البروتين والتقنيات الأحدث. تشمل التحديات الحالية فهم آليات تحويل الطاقة في P-ATPases ، وتوضيح كيفية تنظيم البنية الرباعية للوظيفة والنشاط ، وتحديد المثبطات الفعالة للتطبيق العلاجي في الأمراض البشرية. نؤكد الحالة السداسية لبروتون غشاء البلازما GS-ATPase ونظهر اعتماده على ديناميكياته الهيكلية أو اللزوجة المتوسطة كما هو موضح في نظرية كرامرز.

[الراوي] للبدء ، احصل على عضلة سريعة الارتعاش من النوع البري Oryctolagus cuniculus. علقه في ثلاثة مجلدات من 100 مللي مولر كلوريد البوتاسيوم للنقع. امزج لمدة دقيقة واحدة ، تليها دقيقة واحدة من الراحة المثلجة. الطرد المركزي للعينة عند 1,500 جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق لإزالة بقايا الأنسجة. اجمع المادة الطافية في أنبوب ، ثم قم بتجانسها بمطحنة الأنسجة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي المتجانس ، متبوعا بالطاف. الكريات في حوالي 40 مل من 0.5 السكروز المولي. الآن ، قم بالطرد المركزي للتعليق عند 12,000 جم عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. قم بتخفيف المادة الطافية الناتجة في 0.6 مولار كلوريد البوتاسيوم و 0.15 مولار من السكروز قبل الطرد المركزي. قم بتعليق الحبيبات التي تحتوي على صفائح حوصلة شبكية ساركوبلازمية في مخزن مؤقت يحتوي على 0.3 سكروز مولي, 0.1 كلوريد بوتاسيوم مولار, و 5 مللي مولار تريس هيدروكلوريد عند درجة الحموضة 7.0. Aliquot الحويصلات الشبكية الساركوبلازمية في أحجام 1 ملليلتر. احتضان تعليق الحويصلة الشبكية الساركوبلازمية على الجليد لمدة 10 دقائق مع تحريض لطيف ، ثم جهاز الطرد المركزي. قم بتعليق الحبيبات في أقل من 3 ملليلتر من 25 مللي مولار Tris-hydrochloride عازلة. بعد تجانس التعليق ، اضبطه على الحجم النهائي البالغ 10 ملليلتر باستخدام عازلة Tris-hydrochloride. تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة لوري. أضف azolectin بمعدل 5 ملليغرام لكل مليلتر ثم أضف 0.85 Zwittergent 3-14. قم بتجانس التعليق مرة أخرى وجهاز الطرد المركزي عند 100,000 جم عند 4 درجات مئوية لمدة 60 دقيقة. اجمع المادة الطافية في أنبوب جديد. قم بتخفيفه بنسبة 1 إلى 2 مع 2 مللي مولار EGTA عند الرقم الهيدروجيني 7.2. صب المعلق برفق على تدرج تركيز تريهالوز متقطع في المخزن المؤقت Tris. ثم جهاز الطرد المركزي كما كان من قبل وجمع الحبيبات الصفراء الشفافة قليلا. الحبيبات برفق في حجم صغير من المخزن المؤقت Tris. قم بقياس تركيز البروتين ، ثم قم بتخفيفه لضبط تركيز البروتين إلى 2 ملليغرام لكل ملليلتر. لنشاط ATPase ، قم بإعداد 1 مليلتر من خليط التفاعل. دوامة اختبار التفاعل للتجانس ، ثم احتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أضف 0.9 وحدة من نازعة هيدروجين L-lactate و 1.5 وحدة من بيروفات كيناز. أضف 10 ميكروغرام من SERCA لبدء تفاعل ATPase. راقب تغير الامتصاص كل ثانية لمدة 600 ثانية عند 340 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي الذي يحتوي على حامل خلية ثرموستاتي لتحديد تكوين NAD. بالنسبة لمقايسة وضع العلامات الخاصة ب SERCA مع الفلوريسين إيزوثيوسيانات ، أو FITC ، قم أولا بتعليق 20 ميكروغراما من SERCA في 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت لوضع العلامات. دوامة لخلط جيدا. ثم احتضان العينات في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 و 10 و 7 و 5 و 2 دقيقة. لإيقاف تفاعل وضع العلامات ، أضف حجما متساويا من المخزن المؤقت للتوقف عن البرد المثلج. احتضن على الجليد في الظلام لمدة 5 دقائق. أخضع SERCA المسمى FITC إلى SDS-PAGE. قم بتعريض المواد الهلامية الشفافة للأشعة فوق البنفسجية بطول موجي يبلغ 302 نانومتر وقم بتوثيق النتيجة. أخيرا ، وصمة عار الجل باللون الأزرق. صورة توثيق النتيجة. لتحليل أطياف ثنائية اللون الدائرية ، قم أولا بتعليق SERCA في 400 ميكرولتر من 10 مللي مولار من الفوسفات المؤقت بدرجة الحموضة 7.0 عند 25 درجة مئوية. قم بتحميل العينة في خلية بطول مسار 0.1 سم. الآن ، اضبط نطاق الأطياف فوق البنفسجية البعيدة بين 190 و 260 نانومتر والدقة الداخلية وعرض النطاق الترددي على 1 نانومتر. سجل إشارة ازدواج اللون الدائرية بسرعة 50 نانومتر في الدقيقة عند 25 درجة مئوية. أظهر جل SDS-PAGE الملون باللون الأزرق Coomassie إثراء نطاق بروتين SERCA مع تقدم التنقية. أدت خطوة تنقية SERCA النهائية باستخدام الطرد المركزي الفائق على تدرج تركيز تريهالوز إلى نقاء يتجاوز 90٪. احتوت حويصلات الشبكة الساركوبلازمية على كمية عالية من SERCA ، مع ما يقرب من 73٪ من إجمالي البروتين في الحويصلات المقابلة ل P-ATPase. لوحظ نمط حركي Michaelis-Menten ل SERCA المنقى في معدل التحلل المائي ATP مقابل منحنى تركيز ATP ، مما يؤكد وظيفته الأنزيمية. كشفت مؤامرة Lineweaver-Burk عن ثابت Michaelis يبلغ حوالي 10 ميكرومول ل ATP ، بما يتفق مع القيم التي تم الإبلاغ عنها سابقا. أشارت ملصقات FITC ل SERCA إلى موقع ربط النيوكليوتيدات السليم. يتوافق نطاق SERCA الملون باللون الأزرق Coomassie تماما مع الفرقة المسماة FITC. أكد التحليل الطيفي ثنائي اللون الدائري الجودة الهيكلية العالية ل SERCA المنقى ، حيث يشير طيفه إلى عناصر بنية ثانوية محددة جيدا.