استخراج وتنظيف الأنسجة تحضير عينات الدماغ والحبل الشوكي للفئران

يركز بحثنا على كيفية توسط الجهاز العصبي المركزي في الوظائف المعرفية وتفاعله مع الجهاز المناعي. نحن نهدف إلى تحسين طرق فحص الدماغ والحبل الشوكي ، ومعالجة الأسئلة الأساسية حول هذه التفاعلات. تحافظ هذه الطرق على الدماغ بأكمله والحبل الشوكي سليمين ، مما يساعدنا على رسم خريطة للخلية بشكل أكثر شمولا باستخدام إزالة الأنسجة. كما أنه يجعل العملية أسرع وأكثر دقة ، مما يقلل من الوقت والأخطاء مقارنة بطرق التقسيم والتصوير التقليدية.

لقد قمنا برسم خرائط للدماغ ومناطق الحبل الشوكي المتصلة بالرئتين التي تنتج . سيركز بحثنا على استكشاف التواصل المناعي العصبي بين الدماغ والحبل الشوكي والرئتين. وكيف يؤثر هذا التفاعل على الاستجابات المناعية.

[مدرب] للبدء ، قم بتثبيت أطراف الماوس على لوح الأكريليك العريض باستخدام المشابك الفولاذية. باستخدام المقص ، اقطع الجلد بين عظمي الفخذ واستمر في القطع لأعلى حتى تصل إلى الحجاب الحاجز. افتح جانبي الصدر من خلال الحجاب الحاجز باستخدام المقص والملقط المستقيم لكشف القلب. أدخل إبرة تسريب مقاس 0.7 ملم متصلة بأنبوب تروية في البطين الأيسر، وقم بعمل شق من واحد إلى ملليمترين في الزائدة الأذينية اليمنى. بعد التروية ، افصل الجلد على ظهر ورأس الفأر باستخدام مقص العيون. قطع العمود الفقري عند النقطة التي يتقاطع فيها الخط الذي يربط الحواف الخلفية العلوية لكلا الطرفين مع العمود الفقري. قم بإزالة الأنسجة العضلية والدهنية من رقبة الفأر وظهره لكشف العمود الفقري والجمجمة. باستخدام المقص الوريدي ، قم بقص فجوة خط الوسط بين الجانبين الأيسر والأيمن من العمود الفقري والحبل الشوكي من الطرف السفلي للقناة الفقرية. ثم قم بإزالة الجزء العلوي والجوانب الجانبية من العمود الفقري المقطوع لفضح الحبل الشوكي. كرر الخطوات حتى تصل إلى اتصال الدماغ. ضع طرف شفرة واحدة من المقص الوريدي بين الثقبة الماغنوم والدماغ. حرك وقطع على طول الخيط المتوسط السهمي لفتح الجمجمة. استخدم الملقط لإزالة الجمجمة وفضح الدماغ. الآن ، باستخدام الملقط والمقص الوريدي ، قم بإزالة أنسجة الحبل الشوكي في دماغ الفأر من نهاية الجمجمة. استخدم ملقط تشريح لإزالة غشاء الحبل الشوكي تحت المجهر الاستريو. بعد ذلك ، باستخدام الغرز ، قم بتثبيت عينة الحبل الشوكي في الدماغ في لوحة التثبيت. أضف ما لا يقل عن 20 ضعف حجم العينة البالغ 4٪ بارافورمالدهايد. بعد التثبيت ، تخلص من بارافورمالدهيد واغسل العينة ثلاث مرات باستخدام PBS. للبدء ، قم بإصلاح الحبل الشوكي لدماغ الفأر المستخرج في بارافورمالدهايد. بالنسبة لمحلول إزالة الدهون ، امزج المحلول A و B بنسبة كتلة تسعة إلى واحد. أضف 50 مل من محلول إزالة الدهون إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر وضع الأنسجة الثابتة فيه. بعد الحضانة في المحلول C ، قم بتغيير المحلول وضع طبق الثقافة مع العينة مغمورة بالكامل في المحلول C على صندوق خفيف بخط مقياس. لتحضير محلول الجل ، أضف 147 جراما من المحلول C وثلاثة جرامات من الاغاروز إلى زجاجة زجاجية سعة 200 مل. اخلطي المكونات جيدا بقضيب التحريك ، ثم ضعيها في الميكروويف حتى يذوب الاغاروز. انقل محلول الجل إلى فرن المختبر على درجة حرارة 37 درجة مئوية. صب طبقة بعمق ملليمترين من محلول جل مقسى 37 درجة مئوية في القالب ، وقم بتبريده في ثلاجة أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة حتى يصبح شبه صلب. ضع العينة المتطابقة مع معامل الانكسار في القالب ، وأضف محلول الجل إلى المستوى أو أقل قليلا من الجزء العلوي من العينة. ضع القالب مرة أخرى في الثلاجة أربع درجات مئوية لمدة ساعتين. غطيها بقلة غطاء وضعيها في الثلاجة مرة أخرى. قم بإزالة زلة الغطاء بالملاقط وأخرج العينة المضمنة. أضف 30 مل من محلول التصوير إلى أنبوب سعة 50 مليلتر واغمر العينة في المحلول. ضع مادة لاصقة 502 لتثبيت العينة بإحكام على حامل العينة ، قبل تثبيت الحامل على جهاز التصوير. قم بتشغيل برنامج المسح وحدد مستوى التكبير 4X في قسم التكبير. انقر فوق زر المعايرة لتنشيط وضع المعايرة. انقر فوق زر المعاينة للدخول إلى وضع المعاينة. ثم انقر فوق زر حركة الاتجاه Z لتحريك العينة ببطء لأعلى من أسفل حجرة العينة حتى تمر ورقة الضوء التي تم إنشاؤها عبر العينة. حدد خيار قناة الليزر ووضع الإضاءة المناسبين. حدد اتجاه مسار المسح الضوئي للعينة. انقر فوق الزر المسح التلقائي لبدء التقاط صور العينة. نجح البروتوكول في الحفاظ على دماغ الفأر والحبل الشوكي بالكامل مع الحفاظ على إشارات الفلورسنت السليمة للتصوير الواضح. تصور التصوير الفلوري لعينة الحبل الشوكي في الدماغ بوضوح الهياكل العصبية التفصيلية. قدمت صور التكبير الأعلى تصورا محسنا للخلايا الفردية المصنفة بالفلورسنت.