طريقة فعالة لاستخراج ظهارة قناة فالوب البشرية لتحليلات الخلية المفردة

ينصب تركيزنا البحثي على فهم ومكافحة مقاومة العلاج الكيميائي في سرطانات المبيض. نحن نهدف إلى اكتشاف الآليات والمجموعات السكانية الفرعية للخلايا التي تقود المقاومة والأهداف الجديدة للقضاء على هذه المجموعات العدوانية.

يسهل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية توصيف المجموعات السكانية الفرعية في أورام المبيض غير المتجانسة. نحن نستفيد من الخلايا الظهارية لقناة فالوب غير السرطانية كخلية أصل طبيعي لتحليلات سرطان المبيض.

سيساعد العزل الفعال للخلايا الظهارية لقناة فالوب في معلق أحادي الخلية المخصب في زيادة فهم بدء مرض سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة. توفر تقنية الهضم الميكانيكية والأنزيمية هذه عملية أكثر كفاءة لاستخراج معلق أحادي الخلية المخصب للخلايا الظهارية لقناة فالوب القابلة للحياة.

[الراوي] للبدء ، اجمع قناتي فالوب البشرية الطازجة في أنبوب سعة 15 أو 50 مليلتر يحتوي على وسائط تفكك وضع الأنبوب على الجليد. انقل قناتي فالوب إلى طبق بتري معقم يحتوي على وسائط تفكك جديدة وضع العينة تحت مجهر تشريح. الآن ، باستخدام ملقط دقيق ومقص Vannas-Tubingen ، قم بتشريح الدهون والأنسجة الضامة وأي أوعية تحيط بالأنابيب. بعد ذلك ، قم بقطع المستوى الإكليلي لقناتي فالوب بالمقص لتشكيل أسطوانات صغيرة بقطر ثلاثة إلى خمسة ملليمترات. استخدم ملقط دقيق = نقطة لتثبيت الأنسجة أثناء القطع. استنشق بعناية وسائط التفكك من الطبق الذي يحتوي على قطع الأنسجة. اغسل قطع المناديل مرتين باستخدام ملليلترين من 1x PBS البارد وقم بتدوير اللوحة برفق. بعد شفط PBS ، احتضان قطع الأنسجة لمدة خمس دقائق في EDTA بارد بخمسة مللي مولار في درجة حرارة الغرفة. شظايا الأنسجة في محلول ملح متوازن تربسين هانكس بارد 1٪ واحتضانه عند أربع درجات مئوية لمدة 40 دقيقة. استنشق محلول الملح المتوازن من التربسين هانكس بنسبة 1٪ واغسل قطع المناديل مرتين في وسط التفكك البارد لتعطيل التربسين. احتضان شظايا الأنسجة في ملليلترين من وسائط التفكك مع 0.4 ملليغرام من DNase لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. تحت مجهر تشريح بينما لا تزال في وسط DNase ، أمسك جزءا من قناة فالوب بالملقط بحيث يكون التجويف موازيا لقاع الطبق. استخدم الملقط للضغط بشكل متكرر على الأنسجة لطرد الخلايا الظهارية من التجويف. تأكد من إطلاق هالة من الخلايا حول الأنسجة. انقل الخلايا المحتوية على الوسائط إلى أنبوب معقم سعة 15 ملليلترا. اغسل طبق بتري مرتين بوسائط التفكك وامزج الغسالات في نفس الأنبوب. تخلص من شظايا الأنبوب اللحمي المتبقية. لحصاد الخلايا ، قم بطردها بوزن 500 جرام لمدة خمس دقائق. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسائط التفكك. الآن ، امزج 10 ميكرولترات من تعليق الخلية بحجم متساو من التربان الأزرق. ماصة 10 ميكرولتر من الخليط في شريحة عد الغرفة وإدخالها في عداد الخلايا لتحديد عدد الخلايا. أعد تعليق الخلايا في تسعة ملليلتر من وسائط التفكك التي تحتوي على الكولاجيناز من النوع الأول و DNase. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة في شاكر مداري مضبوطة على 200 دورة في الدقيقة. لحصاد الخلايا ، جهاز الطرد المركزي بوزن 500 جرام لمدة خمس دقائق. بعد شفط المادة الطافية ، قم بتعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من وسائط التفكك لغسل الكولاجيناز. مرر تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر إلى أنبوب سعة 50 مليلتر وقم بالطرد المركزي للمرشح عند 500 جرام لمدة خمس دقائق. إذا ظهرت حبيبات الخلية باللون الأحمر ، فقم بإعداد مخزن مؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء لتحلل خلايا الدم الحمراء. استنشق الوسائط من الحبيبات ، وأضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء المخفف ، واحتضان العينة على الجليد لمدة ثلاث دقائق. لإيقاف تحلل كرات الدم الحمراء ، أضف 45 مل من 1x PBS إلى الأنبوب. الطرد المركزي الأنبوب على وزن 500 جرام لمدة خمس دقائق. بعد حصاد الخلايا وإعادة تعليقها في مليلتر واحد من وسائط التفكك ، امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية بحجم متساو من التريبان الأزرق. ماصة 10 ميكرولتر من الخليط في شريحة عد الغرفة وإدخالها في عداد الخلية. أكد تحليل قياس التدفق الخلوي عزل مجموعة الخلايا الظهارية القابلة للحياة والمخصبة من أنسجة قناة فالوب بمتوسط قابلية للحياة يبلغ 82٪. بعد إخراج الخلايا المناعية الإيجابية CD45 ، شكلت الخلايا الظهارية الموجبة ل EpCAM ما معدله 80٪ من العينة ، بينما كان تلوث الخلايا اللحمية الإيجابية CD10 ضئيلا عند 7.8٪. شكلت الخلايا الظهارية المعزولة مجموعات شبيهة بالحصى ملتصقة في ثقافة ثنائية الأبعاد بعد أربعة إلى ستة أيام من الطلاء ، مما يؤكد الهوية الظهارية. كشفت الكيمياء المناعية أن معظم الخلايا المستزرعة عبرت عن EpCAM و PAX8 مع عدد قليل فقط من الخلايا الإيجابية للفيمنتين. كانت الخلايا الهدبية موجودة في الثقافة.