تحسين توصيل الحويصلة خارج الخلية باستخدام سقالة مطبوعة حيوية ثلاثية الأبعاد بغمد أساسي لإدارة الجروح المزمنة

يتمثل نطاق البحث في تطوير تصميم متقدم لتضميد الجروح النشط بيولوجيا من أجل الإدارة الفعالة للجروح المزمنة. ستضمن السقالة التحكم والتدهور والتسليم المحلي الفعال للحويصلات خارج الخلية.

يهدف البروتوكول الحالي إلى التغلب على قيود تضميد الجروح التقليدي في إدارة الالتهاب المزمن. على وجه الخصوص ، الافتقار إلى السيطرة والتدهور وإطلاق الحويصلة خارج الخلية في الوقت المناسب.

يقدم هذا البروتوكول في Tuneable نهجا لتقديم العوامل العلاجية بما في ذلك الجينات في الوقت المناسب لمختلف التطبيقات.

توفر جميع النتائج رؤى جديدة حول تخصيص سقالة لأنواع مختلفة من الجروح وتعزيز العلاجات التجديدية عن طريق تحميل الحويصلات خارج الخلية بجزيئات نشطة بيولوجيا محددة.

سيقوم مختبرنا ببناء منصة أبحاث انتقالية لمعالجة التئام جروح السكري.

[الراوي] للبدء ، قم بإذابة قارورة من الخلايا الجذعية الوسيطة بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية. قم بإزالة القارورة عندما تبقى قطعة جليد صغيرة. نقل محتويات قارورة الخلايا الجذعية الوسيطة بالكامل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على وسط كامل. الطرد المركزي للخلايا عند 200 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من الوسط الكامل الدافئ. ثم انقل الخلايا إلى قارورة T25 تحتوي على أربعة ملليلتر من الوسط الكامل. قم بإمالة قارورة T25 برفق لضمان توزيع الخلايا بالتساوي. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ إلى 80٪ ، استنشق الوسط المستهلك من قارورة T25. أضف ثلاثة ملليلتر من PBS الطازج إلى القارورة لإزالة أي خلايا متبقية. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من محلول التربسين 0.25٪ إلى القارورة واحتضنها. مراقبة انفصال الخلية تحت المجهر بتكبير 4x. أضف الآن أربعة ملليلتر من الوسط الدافئ الكامل إلى القارورة والماصة لأعلى ولأسفل فوق السطح إلى انفصال. ثم انقل تعليق الخلية إلى جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر اثنين. بعد الطرد المركزي ، قم بإعادة تعليق حبيبات الخلية في وسط جديد وكامل ، واحسب الخلايا. ثم انقل الخلايا إلى قارورة T75 بكثافة بذر تبلغ 5000 خلية لكل سنتيمتر مربع. احتضان قارورة T75 عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 72 ساعة ، اجمع الوسط المكيف من الخلايا لعزل الحويصلة خارج الخلية. لعزل الحويصلات خارج الخلية أو المركبات الكهربائية ، قم بالطرد المركزي ل 13 مل من الوسائط المكيفة المجمعة عند 800 جم لمدة 15 دقيقة لإزالة الحطام الخلوي. استخدم مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر لتصفية المادة الطافية وإزالة الجسيمات الكبيرة. أضف الآن خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لهطول الأمطار إلى الوسائط المكيفة المفلترة. دوامة الخليط جيدا للتأكد من أنه متجانس. احتضان الخليط طوال الليل عند أربع درجات مئوية للسماح للحويصلات خارج الخلية بالترسيب. ثم قم بالطرد المركزي للخليط على حرارة 3,220 جم لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية. ضمان توازن الأنابيب. تخلص من المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة خمس ثوان. الآن أعد تعليق حبيبات EV برفق في 200 ميكرولتر من PBS لتجنب إتلاف الحويصلات. قم بإجراء النشاف الغربي للكشف عن علامات الحويصلة خارج الخلية ، بما في ذلك CD63 و CD81 و CD9. تحضير محلول ألجينات الصوديوم الطازج بنسبة 4.5٪ في ماء معقم فائق النقاء. قلب المحلول طوال الليل عند 60 درجة مئوية لضمان الذوبان الكامل. بعد ذلك ، قم بإذابة كربوكسي ميثيل سلولوز في ماء معقم فائق النقاء لتحقيق محلول 3.8٪. قم بالطرد المركزي للأحبار الحيوية المحضرة عند 3,220 جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية لإزالة الفقاعات التي قد تتداخل مع عملية الطباعة. استخدم الآن خلاط الحقنة واخلط ثلاثة ملليلتر من محلول ألجينات الصوديوم المحضر مع المركبات الكهربائية المسمى أو عنصر التحكم Dialymmi. تخلط جيدا برفق لضمان تعليق موحد. استخدم خلاط حقنة آخر لدمج مليلتر واحد من كربوكسي ميثيل سلولوز مع محلول ألجينات لياز المحضر حديثا في ماء معقم فائق النقاء لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 0.5 مللي وحدة لكل مليلتر. قم بتحميل الحبر الحيوي ألجينات الصوديوم EV في نفس الوقت في الجزء الأساسي والحبر الحيوي Carboxymethylcellulose alginate Lyase في جزء غمد إعداد المحقنة. قم بتشغيل برنامج الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد. حدد شكلا أسطوانيا بنمط حشو قطري لإنشاء هيكل السقالة. اضبط قطر الأسطوانة على 20 ملم والارتفاع على 1.1 ملم. قم بتكوين حجم المسام إلى ملليمتر واحد. اضبط سرعات ضخ فوهة اللب والغمد على ملليمتر واحد في الثانية بسمك 0.25 ملم لكل طبقة. قم بتكوين سرعة الحركة إلى ستة ملليمترات في الثانية واطبع أربع طبقات في درجة حرارة الغرفة. استخدم مرطبا مع كلوريد الكالسيوم الهباء الجوي لربط السقالة أثناء عملية البثق. ابدأ في طباعة السقالة على فيلم البوليستر. ضع فوهة جهاز الترطيب على بعد 20 سم تقريبا من رأس البثق لضمان الربط المتقاطع الفعال. اغمر السقالة في محلول كلوريد الكالسيوم بنسبة 2.2٪ لمدة 10 دقائق لإكمال الربط المتقاطع. اشطف السقالة ثلاث مرات بماء معقم فائق النقاء لإزالة كلوريد الكالسيوم الزائد والحبر الحيوي غير الملزم. حلق الجلد الظهري على فأر مخدر لمرض السكري OCTA باستخدام مقص كهربائي لتجنب تهيج الجلد أو إصابته. الآن قم بإنشاء جرح جلدي دائري كامل السماكة بطول ستة ملم على السطح الظهري لكل فأر. ضع برفق السقالة ثلاثية الأبعاد المطبوعة بيولوجيا التي تحتوي على حويصلات خارج الخلية المسماة PKH على فراش الجرح. تأكد من أن السقالة تغطي سطح الجرح بالكامل واضغط برفق باستخدام ملقط معقم لتقليل الجيوب الهوائية. انقل الفئران المخدرة إلى نظام التصوير IVIS بعد ساعتين وأربع ساعات وثماني ساعات و24 ساعة بعد الزرع. في معالج التصوير ، حدد خيار التصوير الفلوري وقم بتنشيط مرشحات الإثارة والانبعاث لصبغة PKH. اضبط إعدادات الكاميرا ، بما في ذلك مجال الرؤية وارتفاع الهدف لتحسين اكتشاف الإشارة. ابدأ في الحصول على الصور ، واحفظ البيانات الناتجة. ثم حرر إشارات الفلورسنت من المركبات الكهربائية المصنفة. أظهرت المركبات الكهربائية الألجينات في سقالة كربوكسي ميثيل سلولوز ألجينات Lyase ملف تعريف إطلاق أسرع مقارنة بمركبات الجينات الكهربائية في كربوكسي ميثيل سلولوز فقط ، خاصة في النقاط الزمنية التي تبلغ ساعتين وأربع ساعات.