استخراج معامل الشباب للأغشية القاعدية الرئوية الأصلية للفئران من خرائط القوة المشتقة من الفحص المجهري للقوة الذرية

في بحثنا ، نحقق في تأثير الخصائص الميكانيكية للمصفوفة خارج الخلية على سلوك الخلية وسلامة الأنسجة. نريد أن نفهم كيف يؤثر التفاعل بين الخلايا وبيئتها الدقيقة على العمليات المرضية مثل تكوين ورم خبيث. من خلال التنقيب عن البيانات ، الخصائص الميكانيكية للغشاء القاعدي الرئوي ، اكتشفنا أن الأغشية القاعدية الأكثر ليونة أكثر مقاومة لغزو الخلايا السرطانية.

تتيح الطريقة المقدمة في بروتوكولنا التقطيع بالتبريد والفحص الميكانيكي للعينات البيولوجية غير المثبتة ، مما يحافظ على الخواص الميكانيكية. وعلاوة على ذلك ، فإنه يوضح طريقة لتحديد معامل يونغ فقط للغشاء القاعدي داخل الجدار السنخي عن طريق إجراءات قياس وتصفية مجهر القوة الذرية الموصوفة في بروتوكولنا. الخطوة التالية هي معرفة المزيد عن ديناميكيات تصلب الغشاء القاعدي ودوره في العمليات التنموية والمرضية لتحسين التشخيص وتوجيه خيارات العلاج.

للبدء ، قم بإزالة القالب الذي يحتوي على درجة حرارة القطع المثلى المجمدة ، أو OCT ، وهي أنسجة رئة الفئران المدمجة المركبة من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر. ضع شريطا لاصقا على الوجهين في وسط شريحة المجهر ذات الحافة المصنفرة. قم بلف أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر فوق الشريط لضمان التصاق قوي وخالي من الفقاعات.

تأكد من أن طول الشريط يتطابق مع عرض كتلة OCT التي تحتوي على العينة. قم بتسمية الشرائح بقلم رصاص، بما في ذلك معلومات العينة وأرقام الأقسام. أدخل شرائح المجهر المعدة في صندوق شرائح.

ضع صندوق الشرائح داخل حجرة التبريد لتبريد الشرائح. بعد ذلك ، املأ الحلقتين الداخليتين لحامل العينة بوسيط OCT. ضع العينة داخل وسيط OCT على حامل العينة.

ضع حامل العينة في حجرة التبريد لمدة 10 دقائق تقريبا حتى يتجمد وسط OCT تماما ويتم تأمين العينة بإحكام. الآن ، قم بتثبيت حامل العينة على مرحلة القطع من التبريد. قم بإرفاق قطعة من الشريط اللاصق أحادي الجانب بالعينة عن طريق الضغط بقوة بإبهام بارد.

أنتج قسما من الأنسجة بحجم 15 ميكرومتر باستخدام التبريد. استخدم فرشاة لتوجيه القسم ومنع الشريط اللاصق من الانفصال أثناء إجراء القطع. استخدم شريحة مجهر مبردة بشريط لاصق على الوجهين واضغط عليها بقوة على القسم لالتقاطها.

ضع الشريحة التي تحمل القسم مرة أخرى في مربع الشريحة. لمعايرة الكابولي باستخدام طريقة الضوضاء الحرارية ، ضع شريحة مجهر على مرحلة العينة من مجهر القوة الذرية ، أو AFM. ضع رأس AFM على مرحلة العينة.

ثم قم بخفض رأس AFM باستخدام محركات السائر حتى تكون الفجوة بين حامل الكابولي وشريحة المجهر حوالي ملليمتر إلى ملليمترين. باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد بإبرة طويلة ، ضع PBS على جانب حامل الكابولي ، مما يسمح له بالتدفق لأسفل وتشكيل الغضروف المفصلي السائل في الفجوة. في برنامج التحكم AFM لإجراء معايرة قائمة على جهات الاتصال، انتقل إلى صفحة الحصول على البيانات وحدد خيار العرض المتقدم.

قم بالوصول إلى مدير المعايرة بالنقر فوق زر قائمة البرجر الموجود في الزاوية العلوية اليمنى. ثم حدد المستند إلى جهة الاتصال كطريقة ، و ناتئ MLCT-F من القائمة المنسدلة الاسم كاسم ناتئ. أدخل فولت واحد في حقل Setpoint ، و 10 في حقل عدد عمليات الفحص.

في صفحة الحصول على البيانات، أدخل نقطة ضبط بجهد واحد لإجراء الاقتراب التلقائي في لوحة التحكم اليسرى. انقر فوق زر سهم التأشير الأزرق لأسفل في الزاوية العلوية اليسرى من الواجهة لبدء النهج التلقائي. عند اكتمال النهج ويكون الكابولي على اتصال بشريحة المجهر، انقر فوق الزر معايرة في نافذة إدارة المعايرة لبدء المعايرة.

بعد اكتمال المعايرة، أغلق نافذة إدارة المعايرة وتأكد من إنشاء ملف معايرة في الدليل المحدد مسبقا الذي يحتوي على نتائج المعايرة المحددة. للبدء ، استرجع شريحة العينة التي تحتوي على أنسجة رئة الفأر المقطعة من الفريزر. ضع شريحة المجهر على مرحلة العينة من AFM.

انقر فوق الزر الذي يحتوي على رمز مفتاح الربط في الزاوية العلوية اليمنى من واجهة المستخدم للانتقال إلى مدير الإعدادات. ضمن قسم إعدادات الاقتراب، اضبط الارتفاع المستهدف على أربعة ميكرومترات. ثم في قسم إعدادات الوضع الحالي ضمن إعدادات الملاحظات المتقدمة، قم بتعيين المضاعف إلى واحد.

في القسم الفرعي فرض الإعدادات في إعدادات الوضع الحالي، حدد بيزو متراجعة من القائمة المنسدلة الوضع في النهاية. في لوحة التحكم اليسرى ، قم بتعيين معلمات منحنيات المسافة البادئة للقوة. بالنسبة ل NanoWizard 4 XP و MLCT ناتئ F المدخلات Setpoint إلى خمسة نانونيوتن ، Z Length إلى ثمانية ميكرومتر ، و Z Velocity إلى 300 ميكرومتر في الثانية.

بعد ذلك ، حدد موقع وحجم خريطة قوة النظرة العامة الأولية لتشمل الجدار السنخي بأكمله ، الممتد من جانب هوائي إلى آخر. اضبط عدد وحدات البكسل على 50 × 50. بعد تسجيل خريطة النظرة العامة ، التقط خريطة قوة أكثر تركيزا بحجم إما ثلاثة في ثلاثة ميكرومترات أو أربعة في أربعة ميكرومترات على الغشاء القاعدي ، مع الحفاظ على عدد وحدات البكسل عند 50 × 50 منحنى.

لتحليل منحنيات المسافة البادئة للقوة ، قم بتشغيل CANTER Processing Toolbox في MATLAB وافتح تطبيق تحليل منحنى القوة. ثم لتحميل خريطة القوة عالية الدقة لقسم الرئة ، انقر فوق تحديد ملف ، وانتقل إلى موقع الحفظ ، وانقر نقرا مزدوجا فوق الملف ، وحدد تحميل البيانات. عند ظهور النافذة المنبثقة التي تطلب قيم معايرة الكابولية، أدخل قيم المعايرة في حقول التحرير المعنية.

انقر فوق الزر "إرسال" للمتابعة. عند نافذة منبثقة ثانية ، تابع إجراء تحميل خريطة التصوير الكمي ، أو QI ، بالنقر فوق الزر إرسال. عند الانتهاء من عملية التحميل ، يتم عرض منحنى القوة الأولي لخريطة القوة على الشاشة.

اضبط عمق الملاءمة في حقل التحرير المقابل على 1.5 ميكرومتر وحدد عبر Hertz fit لخوارزمية البحث عن جهات الاتصال. لتطبيق ملاءمة نموذج Hertz المعدل على جميع منحنيات المسافة البادئة للقوة في خريطة QI ، انقر فوق الزر Keep Apply to all. بعد الانتهاء من تحليل منحنى القوة الأخير ، تظهر نافذة لحفظ الملفات.

انقر فوق نعم وأدخل اسما لملفات النتائج. للتصفية المكانية لخريطة QI من نافذة تحديد التطبيق في CANTER Processing Toolbox ، حدد أداة تصفية النتائج وانقر فوق الزر بدء التطبيق. لتحميل نتائج الملاءمة ، انقر فوق فتح في شريط القائمة العلوي لواجهة مستخدم أداة تصفية النتائج.

في النافذة المنبثقة اللاحقة ، حدد موقع الزر تعيين الأول ضمن علامة التبويب خرائط JPK وحدد ملف tsv الذي يحتوي على نتائج تحليل منحنى القوة. ثم انقر فوق الزر "تعيين" الثاني وحدد موقع ملف خريطة QI المقابل لملف tsv المحدد. بعد ذلك، انقر فوق إرسال لتحميل بيانات الخريطة وفرض نتائج تحليل المنحنى.

من القائمة المنسدلة القناة المعروضة في الجزء العلوي ، حدد خيار EModul لعرض نتائج معامل يونغ كصورة خريطة. ثم من القائمة المنسدلة لقناة البيانات أسفل مخطط الرسم البياني ، اختر خيار EModul لتصور توزيع قيم معامل Young المحملة لخريطة QI. بعد ذلك ، انقر فوق زر سهم تدفق التلاعب في وسط واجهة المستخدم ، مما يضمن أنه يشير إلى الجانب الأيمن.

قم بتعيين زر تبديل مرشح الصورة إلى موضع تشغيل في لوحة Filter أعلى محاور الرسم البياني. من القائمة المنسدلة هندسة التصفية ، حدد خيار Freehand ثم انقر فوق الزر "إضافة". في صورة القناة العلوية ، ارسم قناع المرشح عن طريق تدوير الغشاء القاعدي أثناء الضغط على زر الماوس الأيسر.

ثم حرر زر الماوس عند الانتهاء وانقر نقرا مزدوجا فوق القناع لتطبيقه على الخريطة. لحفظ ملف نتيجة tsv جديد بقيم معامل Young المقنعة ، انقر فوق حفظ وحفظ الرسم البياني وحفظ البيانات في شريط القائمة العلوي. في النافذة المنبثقة التي تظهر، انقر فوق تحديد الكل لاختيار النتائج المراد كتابتها في ملف tsv.

ثم انقر فوق الزر "موافق" لتأكيد التحديد. في مربع الحوار حفظ، أدخل اسما لملف tsv، واختر موقع الحفظ المطلوب، وانقر فوق موافق لحفظ النتائج التي تمت تصفيتها أظهرت قيم معامل يونغ للغشاء القاعدي الرئوي توزيعا طبيعيا لوغاريتميا بقيمة ذروة تبلغ 9.31 وانحراف معياري قدره 0.18 ، مما ينتج عنه معامل يونغ تمثيلي يبلغ 11.05 كيلو باسكال.

تم تأكيد هذه النتائج بشكل أكبر من خلال مخطط الكمية الكمية.