تطبيق هيدروجيل هيالورونان جديد لزراعة البصيلات ثلاثية الأبعاد ومنهجية حفظ بصيلات المبيض بالتبريد في الفأر

وقد ركز هذا البحث على تطوير نظام ثقافة 3D لنمو البصيلات في المختبر ونضوج البويضة. سيؤدي إنشاء مثل هذا النظام باستخدام مكونات المصفوفة خارج الخلية الأصلية للخلية إلى تعزيز نمو البصيلات. التحدي الأكبر هو تطبيق المعرفة من النماذج الحيوانية على ثقافة البصيلات البشرية.

الوصول إلى أنسجة المبيض البشرية محدود. وتتطلب البصيلات البشرية وقتا أطول بكثير في الثقافة لتحقيق نضوج البويضات. قد يكون نموذج الثقافة ثلاثي الأبعاد الذي تم تطويره في هذه الدراسة مفيدا بشكل خاص لزراعة بصيلات المبيض البشرية ، مما يسمح بالاحتفاظ بالبنية ثلاثية الأبعاد خلال الوقت الطويل اللازم في الثقافة لنضج البويضات.

للبدء ، احصل على المبايض من 10 إلى 14 يوما من صغار الفأر B6D2F1 لهذا الإجراء. ماصة 6 ملليلتر من وسط زراعة البصيلات المتوازن مسبقا ، أو FCM ، في طبقين 60 ملم وتراكب بالزيت المعدني ، واحتضانها. ماصة 1 مل من الكولاجيناز إلى وسط الطبق ، و 3 ملليلتر من أنسجة المبيض ، أو وسائط OT ، في البئر الخارجي.

انقل المبايض إلى محلول الكولاجيناز. في نهاية حضانة الكولاجيناز ، انقل المبايض المعالجة بالكولاجيناز إلى البئر الخارجي لشطفها. قم بتغيير الماصات الدقيقة وانقل المبايض إلى طبق طازج مملوء بوسط OT.

لحصاد البصيلات ، قم بشفط وطرد أنسجة المبيض المعالجة بالإنزيم بشكل متكرر من خلال أطراف الماصة المقطوعة بأحجام مختلفة. مضايقة الأنسجة ميكانيكيا باستخدام 27 إبرة قياس لثمانية إطلاق البصيلات. افحص تحت مجهر تشريح بتكبير 40x واختر بصيلات ثانوية قبل الأذن مع بويضة مركزية محاطة بغشاء قاعدي سليم إلى طبق OT جديد.

ضع طبق FCM2 في الحاضنة لمدة 60 دقيقة قبل بدء عملية التضمين. اصنع قطرتين بحجم 25 ميكرولتر من جل حمض الهيالورونيك بدون بيروكسيد الهيدروجين على الغطاء للشطف. انقل البصيلات أو مجموعات البصيلات ليتم دمجها من طبق FCM إلى قطرة من الهيالورونان ، أو جل HA ، لشطفها خالية من وسط الاستزراع.

ضع طبق FCM مرة أخرى أسفل الفقاعات إلى الغاز. لتضمين البصيلات ، ضع 1 ميكرولتر من قطرة بيروكسيد الهيدروجين 0.03٪ على غطاء طبق 60 ملم. الآن ، أضف 25 ميكرولتر من 3 ملليغرام لكل مليلتر من هلام HA واخلطه.

ماصة ما يقرب من ثمانية [تو] 10 ميكرولتر من [ه] هيدروجين بيروكسيد خليط في اثنين منفصلة بئرين من ثمانية آبار ثقافة طبق. ونقل البصيلات أو مجموعات البصيلات أو شظايا أنسجة المبيض بسرعة إلى وسط كل قطرة. تأكد من عدم وجود فقاعات داخل القطرة.

بعد ثلاث دقائق ، أضف 100 ميكرولتر من وسط زراعة البصيلات المتوازن مسبقا لكل بئر. تراكب بالزيت المعدني الدافئ المتوازن مسبقا واحتضان الطبق. تحضير المعدات والمحاليل المطلوبة لعملية التزجيج.

ضع حامل RI في الفتحة الموجودة في صندوق التبريد الذي يحتوي على النيتروجين السائل. ضع قطرتين من محلول التزجيج المسخن مسبقا 1 ، أو VS1 ، جنبا إلى جنب على غطاء طبق 60 ملم بالقرب من الجزء العلوي. الآن ، ضع بصيلين في القطرة الأولى ، واشطفها ، وانقلهما بسرعة إلى القطرة الثانية من VS1 لمدة خمس دقائق.

أثناء احتضان البصيلات ، قم بعمل ثلاث قطرات VS2 أسفل قطرات VS1 مباشرة. ثم حرك البصيلات بسرعة بالتتابع من خلال قطرات VS2 الثلاثة في غضون 60 ثانية. للتزجيج ، التقط البصيلات من VS2.

اعرض الموجة الحاملة RI ضمن نطاق التشريح. واضبط التركيز لتصور الفتحة الصغيرة في العصا البلاستيكية. إيداع البصيلات مع الحد الأدنى من السوائل في الحفرة.

أسقط العصا البلاستيكية في القشة الخارجية المبردة مسبقا. واستخدم مادة مانعة للتسرب بالموجات فوق الصوتية لإغلاق القش. ضع القش في كأس متصل بقصب التبريد.

قم بتغطية العصا بغطاء واقي بلاستيكي واغمرها في النيتروجين السائل. من أجل تزجيج الناقل المفتوح ، قم بإعداد الحامل عن طريق إدخال جذع CL المعدني في غطاء القارورة الممغنطة ، مما يضمن ثباتا قويا. ضع رفا في صندوق التبريد لحمل قوارير التبريد ، مما يضمن وجود النيتروجين السائل أسفل الجزء العلوي من القوارير.

املأ قارورة تبرد ممغنطة مخترعة بالنيتروجين السائل وضعها في الرف. أمسك الناقل المفتوح CL من خلال الغطاء المغناطيسي المرفق به باستخدام عصا مغناطيسية. اغمس حامل CL في قطرة منفصلة من VS2 لإنشاء فيلم مقاوم للتبريد.

التقط جميع البصيلات أو مجموعات البصيلات وضعها على الفيلم بأقل قدر من السوائل. اغمر CL على الفور في قارورة التبريد المملوءة بالنيتروجين السائل لجذب العينة. ضع قارورة التبريد على قصب التبريد ، ثم قم بتغطيتها بغلاف بلاستيكي.

اغمر القصب في خزان تخزين النيتروجين السائل. قم بإعداد طبق بئر مركزي به 3 ملليلتر من FCM المتوازن مسبقا في البئر الخارجي و 1 مليلتر في البئر المركزي. بعد تراكب الوسط بالزيت ، ضع الطبق تحت الفقاعات للغاز.

ضع 0.5 مل من محاليل الاحترار WS1 و WS2 موازنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية في طبقين من البئر المركزي. انقل قصب التبريد مع عينات من خزان التخزين إلى صندوق تبريد مملوء بالنيتروجين السائل. أولا ، قم بإزالة غطاء قصب السكر البلاستيكي.

ثم احتفظ بالقش مغمورا ، أخرجه من الكأس وحركها في فتحة التثبيت في صندوق التبريد. قطع القشة الخارجية فوق النقطة السوداء مباشرة. ارفع العصا البلاستيكية الداخلية من المصاصة الخارجية واغمس العصا بسرعة في WS1 ، مع الدوران برفق لتفريغ البصيلات في غضون 10 ثوان.

بعد دقيقتين في WS1 ، استخدم ماصة دقيقة لنقل البصيلات أو مجموعات البصيلات إلى WS2 لمدة ثلاث دقائق. ثم انقلها إلى طبق FCM واحتضن البصيلات لمدة ساعة إلى ساعتين في المنتصف جيدا قبل التضمين ، لتسخين الناقل المفتوح CL ، كرر تحضير طبق FCM و WS. انقل قصب التبريد إلى صندوق التبريد وقم بإزالة غطاء القصب البلاستيكي.

استخدم عصا مغناطيسية لرفع غطاء قارورة التبريد حتى يصبح الجذع المعدني ل CL مرئيا. أمسك الغطاء بحامل CL المرفق باستخدام العصا المغناطيسية. واغمر CL بسرعة في WS1 ، مع الدوران لتفريغ البصيلات في غضون 10 ثوان.

تم الحفاظ على نمو البصيلات قبل الأذن في ثقافة هلام الهيالورونان ثلاثية الأبعاد ، مما يحافظ على بنية البصيلات الأصلية مع ظهور القشرة بحلول اليوم 12. أظهرت البصيلات المغلفة في هلام الهيالورونان توسعا شعاعيا بسبب تكاثر الخلايا الحبيبية مع زيادة أقطار البصيلات من حوالي 139.8 ميكرومتر إلى 385.6 ميكرومتر خلال فترة الاستزراع. تم العثور على بويضتين من الطور المبوض بالقرب من المسام بعد محفز موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية.

يبلغ قطر البويضات حوالي 84.8 ميكرومتر. مع المبايض الطازجة ، أظهرت كل من البصيلات الفردية ومجموعات البصيلات معدلات نضج جيدة. أظهرت مجموعات البصيلات من المبايض المحفوظة بالتبريد معدلات نضج أقل مما أدى إلى بثق البويضات المبكر.

كان حفظ البصيلات المعزولة بالتبريد أكثر فعالية من حفظ المبيض الكامل. حقق تزجيج البصيلات على كلا الناقلين معدلات نضج عالية ، بغض النظر عن اختلافات معدل التبريد. سمح نظام الناقل المفتوح CL بالحفاظ على بصيلات متعددة بالتبريد بكفاءة ، مما يقلل من وقت المعالجة.