التقطيع بالتبريد المباشر لرؤوس ذبابة الفاكهة لتعزيز تلطيخ مضان الدماغ والتلوين المناعي

يدرس فريقنا اضطراب التمثيل الغذائي والقلب ونوم العضلات والشيخوخة باستخدام نموذج ذبابة الفاكهة. توضح ورقة Jove هذه البروتوكول المبسط المفصل لمعالجة أنسجة المخ ، بما في ذلك قطع الرأس والتثبيت والاستئصال بالتبريد والتلوين والتصوير. كانت مجموعتي البحثية رائدة في تطوير نموذج ذبابة الفاكهة لدراسة العديد من الأمراض البشرية والشيخوخة.

لقد حققنا أيضا في التدخل مثل التغذية المقيدة بالوقت وممارسة الرياضة. نحن نستخدم التعلم الآلي والنهج الجزيئي لدراسة عوامل مثل إيقاع الساعة البيولوجية وعلم الوراثة للكشف عن تأثيرها على السلامة الخلوية وعلم وظائف الأعضاء والسلوك. يتجنب بروتوكول أبحاث ذبابة الفاكهة المبسط هذا التشريح المعقد ، ويتطلب تنفيذا بيد واحدة فقط ، ويلغي الحاجة إلى الفحص المجهري متحد البؤر المكلف ، مما يزيد من إمكانية الوصول ويقلل من الاعتماد على المعدات.

للبدء ، احصل على الذباب في قوارير الشيخوخة ، ثم افتح الصمام الموجود على حصيرة ثاني أكسيد الكربون ، وقم بتفريغ الذباب بسرعة على السجادة لمنع الهروب. بمجرد أن يصبح الذباب فاقدا للوعي في الغالب ، ضع الذباب تحت مجهر SZ61 عن طريق تحريك السجادة تحت العدسة الموضوعية. اضبط التكبير والتركيز البؤري حتى يصبح الذباب مرئيا بوضوح ومريحا لقطع الرأس.

باستخدام مقص زنبركي ، ضع الشفرات بين الصدر ورأس الذبابة واضغط بقوة لقطع رأس خمسة إلى 10 رؤوس ذبابة لكل مجموعة تجريبية. ضع أي ذباب ومستعمل مرة أخرى في قارورة الشيخوخة. باستخدام فرشاة ، انقل رؤوس الذباب المقطوعة برفق إلى أنابيب مسمى 1.5 مليلتر موضوعة على الجليد.

بعد إزالة الأنابيب من الجليد ، ضع ماصة 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد و PBS في كل أنبوب لضمان غمر جميع رؤوس الذباب بالكامل. إذا التصقت الرؤوس بجدران الأنبوب ، فادفعها برفق لأسفل باستخدام فرشاة أو اضغط على الأنبوب برفق على سطح أفقي لضمان ملامسة المحلول بشكل صحيح. ثم احتضان الأنابيب لمدة 15 دقيقة على شاكر مداري في إعداد متوسط.

تخلص من محلول بارافورمالدهايد واستبدله ب PBS ، مما يضمن غمر جميع رؤوس الذباب. بعد الغسيل النهائي ، انقل رؤوس الذبابة إلى محلول سكروز بنسبة 10٪ في PBS ، مع التأكد من غمرها داخل الأنبوب. املأ القالب الملصق بسعة 50٪ تقريبا بدرجة حرارة القطع المثلى أو مركب OCT ، مما يسمح له بالانتشار إلى جميع الزوايا الأربع للقالب.

باستخدام فرشاة ، ضع رؤوس الذباب الثابتة المجمعة بعناية على سطح مركب OCT داخل القالب. باستخدام طرف الملقط ، ادفع كل رأس برفق إلى قاع القالب ، مع التأكد من توجيه العينين لأسفل لقطع المستوى الإكليلي. قم بمحاذاة جميع الرؤوس بعناية في أبعاد X و Y و Z للتأكد من أن جميع الأقسام ستحتوي على جميع المجموعات التجريبية في وقت واحد.

بعد محاذاة الرؤوس بشكل صحيح ، ضع القوالب بعناية مباشرة في الفريزر على درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر للتجميد. بمجرد تجميد القالب في الغالب ، املأ المساحة المتبقية بمركب OCT. لتقطيع القالب بالتبريد ، ضع كمية وفيرة من مركب OCT على الجزء العلوي من القالب لربط لقمة الظرف بالقالب.

ضع القطعة بشكل مسطح في الأعلى واتركها تتجمد تماما داخل ناظم التبريد ، والتي تستغرق عادة خمس دقائق. ثم حرر البت وكتلة OCT من القالب. ضع الكتلة في ظرف الظرف ، مع التأكد من الحفاظ على الاتجاه المناسب من أعلى إلى أسفل وشد مفتاح الظرف حتى تصبح الكتلة في مكانها بإحكام.

باستخدام مقابض الضبط وأدوات التحكم في عمق الظرف ، قم بمحاذاة الكتلة مع الشفرة. اضبط عرض القسم على ناظم البرد على 20 ميكرومتر وقم بقص كل شريحة باستخدام حركة بطيئة ومتسقة مع السماح للزجاج المضاد للانزلاق بالتقاط كل شريحة. ثم التقط الأقسام باستخدام الشرائح الدافئة عن طريق لمس الشريحة إلى الحافة الأقرب للقسم والسماح للقسم بالارتفاع إلى الشريحة.

اترك الشرائح تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل ، ولكن ليس أكثر من ساعة واحدة. خذ رؤوس ذبابة الفاكهة المقطوعة بالتبريد واستخدم شفرة حلاقة لإزالة أي مركب OCT متبقي على حواف الشريحة ، مما يترك مساحة لحدود كارهة للماء. ثم استخدم قلم تحديد كاره للماء لرسم حد حول كل شريحة واتركها تجف لمدة خمس دقائق.

اغسل جميع الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام PBS عن طريق سحب الشرائح برفق. بعد غسل الشرائح، قم بتعبئة الماصة 3٪ BSA في محلول حجب المحلول الملحي المخزنة من Tris على الشرائح واحتضانها لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة. ثم تخلص من محلول الانسداد وقم بتقطيع محلول الجسم المضاد الأساسي على الشرائح.

احتضان الجسم المضاد طوال الليل عند أربع درجات مئوية أو لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام مناديل مبللة لمنع الجفاف. تخلص من محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام PBS. ثم أضف محلول الجسم المضاد الثانوي إلى الشرائح واحتضنه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد غسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS ، اترك كمية صغيرة فقط من PBS على الشريحة. بعد ذلك، باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر، أضف ثلاث إلى خمس قطرات من وسائط التثبيت الصلبة التي تحتوي على DAPI بالتساوي عبر الشريحة. ضع زلة غطاء على الشريحة مع التأكد من عدم تكوين فقاعات هواء أثناء وضعه.

تعامل بعناية مع الشرائح المثبتة حديثا وقم بتخزينها بشكل مسطح حتى تجف وسائط التثبيت تماما. إذا كانت هناك حاجة إلى تخزين طويل الأجل ، فقم بإغلاق حواف الشرائح. التقط صورا للشرائح في أسرع وقت ممكن لتقليل تسوس الفلورسنت.

أثناء الحصول على الصور، ركز على كل موضوع فريد في نفس القناة لتحقيق الاتساق عبر جميع المجموعات التجريبية. معايرة التعريضات الضوئية لكل قناة لتجنب التعرض المفرط في جميع القنوات المحددة. تأكد من أن التعرضات المختارة تظل ثابتة ومناسبة لجميع الموضوعات ، خاصة بين المجموعات التجريبية المختلفة.

تم تحديد التعبير عن علامة الجسم المضاد ApoE بوضوح في مناطق الدماغ لعينات Elav + و Elav-ApoE4. تمت الإشارة إلى تراكم الدهون من خلال تلطيخ النيل الأحمر ، والذي كان مرئيا في مناطق الدماغ في كلا النمطين الجينيين.