Fine Adjustment of <em>Caenorhabditis elegans</em> Orientation on Channeled Agar Pads for Imaging Neuroregeneration

Tina Thuy N. Nguyen Hoang; Chirayu P. Sanganeria; Samuel H. Chung

doi:10.3791/67811

الضبط الدقيق لاتجاه Caenorhabditis elegans على وسادات أجار الموجهة لتصوير التجديد العصبي

JoVE Journal
Neuroscience

This content is Free Access.

JoVE Journal Neuroscience

Fine Adjustment of Caenorhabditis elegans Orientation on Channeled Agar Pads for Imaging Neuroregeneration

الضبط الدقيق لاتجاه Caenorhabditis elegans على وسادات أجار الموجهة لتصوير التجديد العصبي

Full Text

873 Views

05:12 min

January 31, 2025

DOI: 10.3791/67811-v

Tina Thuy N. Nguyen Hoang¹, Chirayu P. Sanganeria¹, Samuel H. Chung¹

¹Department of Bioengineering,Northeastern University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a protocol for creating channeled agar pads using PDMS molds from vinyl records. The aim is to better orient Caenorhabditis elegans for enhanced imaging contrast, specifically in neuroregeneration research. The approach addresses challenges associated with imaging adult C. elegans by maintaining their orientation and reducing stress during observation.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Neuroregeneration
Imaging Techniques

Background

The laboratory focuses on mechanisms of mammalian central nervous system regeneration.
C. elegans serves as a model organism for studying neuronal regeneration.
Challenges include air bubbles and inconsistent mold thickness in PDMS creation.
Adult C. elegans have issues with imaging due to size and pigmentation.

Purpose of Study

To fabricate molds that allow for precise orientation of C. elegans.
To improve imaging quality of neuronal structures during regeneration.
To facilitate better cell targeting through controlled animal placement.

Methods Used

Use of PDMS molds for creating channeled agar pads.
C. elegans serves as the biological model organism.
The method allows the reuse of PDMS molds and includes important preparation steps for consistent results.
Critical steps include thorough mixing, vacuum desiccation, and careful pouring of solutions.

Main Results

Channeled agar pads improved the orientation of C. elegans, aligning crucial anatomical landmarks.
Fluorescent imaging validated proper orientation and enhanced visibility of neuronal structures.
Regenerated neuron fibers were positioned closer to the imaging objective, minimizing scattering.

Conclusions

This study demonstrates a New methodology for enhancing imaging of C. elegans in neuroregeneration studies.
The use of channeled agar aids in maintaining physiological relevance and improving visualization.
These advancements facilitate better understanding of neuronal regeneration mechanisms.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using channeled agar pads?

Channeled agar pads enhance the imaging quality of C. elegans by ensuring proper orientation and reducing stress on the animals, which promotes consistent physiological conditions.

How are PDMS molds created?

PDMS molds are made by mixing a fast cure agent with the base, followed by careful vacuum desiccation and curing at high temperatures to ensure uniform thickness.

What imaging techniques are utilized in this study?

Fluorescent dissecting and inverted microscopy are used to verify the orientation and enhance the visibility of neuronal structures within C. elegans.

What challenges are addressed by this protocol?

The protocol addresses issues such as air bubble formation and maintaining consistent mold thickness, which can hinder accurate imaging of C. elegans.

Can the PDMS molds be reused?

Yes, once created, the PDMS molds can be reused multiple times for creating channeled agar pads, making the process efficient.

How does this method contribute to understanding neuroregeneration?

By improving imaging techniques, this method allows for a better analysis of neuronal regeneration processes in C. elegans, providing insights into mammalian CNS regeneration mechanisms.

هنا ، نقدم بروتوكولا لتصنيع وسادات أجار موجهة باستخدام قوالب PDMS التي تم إنشاؤها من سجلات الفينيل. تمكن القنوات المستخدمين من توجيه Caenorhabditis elegans بدقة لتحسين تباين التصوير وتسهيل مقارنة الهياكل. هذه القدرات مفيدة بشكل خاص في دراسات التجديد العصبي.

ينصب التركيز الأساسي لمختبرنا على تحديد الآليات الكامنة وراء تجديد الجهاز العصبي المركزي للثدييات باستخدام الكائن الحي النموذجي ، C.elegans. ندرس التجديد عبر الخلايا العصبية المتعددة ونبحث عن هوية إشارة التكييف المسبق التي تؤدي إلى تعزيز تجديد الجهاز العصبي المركزي. تشمل التحديات التجريبية الحالية إدخال فقاعات الهواء أثناء استبدال اللوح الزجاجي على سجل الفينيل والحصول على سمك قالب موحد.

ومع ذلك ، بمجرد إنشاء قالب PDMS ، يمكن إعادة استخدامه للفكين. الفجوة البحثية التي نعالجها هي سيطرة محدودة على اتجاه البالغة. البالغة أكبر في القطر وتكون أكثر صبغة مما يتسبب في حدوث مشكلات في التصوير في طائرات Z الأعمق.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن مقدمة زلة الغطاء تغير أيضا الاتجاه الأولي. تساعد القنوات في الحفاظ على اتجاه عند إدخال زلة الغطاء ، مما يسمح للخلايا المستهدفة بأن تكون أقرب إلى هدف التصوير. تقلل القنوات أيضا من الضغط على التي تعزز علم وظائف الأعضاء الطبيعي ، وتشجع التكوين الخطي للحيوانات ، وتخلق الاتساق عند التصوير عبر متعددة.

للبدء ، اسكب نسبة واحدة إلى 10 من عامل المعالجة السريع إلى القاعدة في طبق وزن يمكن التخلص منه. اخلطي السائل غير المعالج جيدا لمدة 45 ثانية حتى يتجانس تماما ويمتلئ بالفقاعات. ثم ضع الصينية التي تحتوي على خليط PDMS غير المعالج في مجفف مفرغ من الهواء عند إمالة.

قم بتدوير الضغط بين سالب 0.09 كيلو باسكال و0.1 كيلو باسكال تحت الصفر ثلاث مرات للسماح لفقاعات الهواء بالظهور. اشطف سجل الفينيل واللوح الزجاجي جيدا بالماء منزوع الأيونات ، واترك سجل الفينيل يجف تماما في الهواء قبل الاستخدام مرة أخرى. ضع ورقة من رقائق الألومنيوم فوق اللوح الساخن لالتقاط أي PDMS زائد.

ثم ضع شريحة زجاجية في كل طرف من طرفي سجل الفينيل لضبط سمك القالب ، مما يضمن ارتفاعا موحدا عند الضغط على اللوح الزجاجي على نظام PDMS غير المعالج. الآن ، اسكب سائل PDMS غير المعالج على جانب واحد من سجل الفينيل. قم بإمالة اللوح الزجاجي وإسقاطه ببطء للسماح للهواء المحبوس بالخروج.

ثم عالج PDMS عند 100 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بإزالة سجل الفينيل من اللوح الساخن واتركه ليبرد. بعد ذلك ، قم بتقشير PDMS بعناية من سجل الفينيل لتجنب التمزق.

ثم قشر PDMS من اللوح الزجاجي. باستخدام شريحة زجاجية جديدة كدليل ، قم بقص PDMS بشفرة حلاقة حادة لإنشاء قالب أجار موجه. قشر PDMS الزائد لإظهار قالب أجار الموجه النهائي.

أضف 0.6 جرام من أجار و 30 مل من المرق السائل المتوسط لنمو الديدان الخيطية في قارورة. ضعي لوح التقليب في القارورة وسخني المزيج على طبق ساخن ، واضبطيه على 120 درجة مئوية. أضف 120 ميكرولترا من محلول مخزون أزيد الصوديوم بعد ذوبان الجل.

ثم اغسل قالب PDMS جيدا بالماء واتركه يجف في الهواء. ضع قالب PDMS بين مجموعتين من أزواج الشرائح للتحضير للاستخدام. باستخدام ماصة، اسحب محلول الأجار لأعلى ولأسفل لتسخين طرف الماصة وقم بوضع 300 ميكرولتر من الأجار المذاب على قالب PDMS.

أخيرا ، ضع شريحة مجهرية مباشرة على الأجار ، مع التأكد من وضعها على الشرائح على الجانبين. قم بإزالة الشريحة بعد أن يبرد الأجار تماما. سهلت وسادات الأجار الموجهة التوجيه الدقيق ل Caenorhabditis elegans عن طريق دحرجة لمحاذاة المعالم ، مثل الفرج والأمعاء على شكل حرف S ، والتي تم التحقق منها تحت مجهر تشريح الفلورسنت قبل نقلها إلى المجهر المقلوب.

تحقق التصوير الفلوري من الاتجاه الصحيح ل Caenorhabditis elegans على وسادات أجار الموجهة كما هو موضح في الصور المجهرية الفلورية. تعمل وسادات أجار الموجهة على تحسين جودة التصوير لتجديد الخلايا العصبية عن طريق وضع ألياف الخلايا العصبية المتجددة بالقرب من العدسة الشيئية ، مما يقلل من تشتت الضوء وامتصاصه.