بروتوكول حقن العصب المبهم المباشر للفئران

نجري دراسات قبل السريرية في العلاج باستبدال الجينات. نستخدم المختبر لإنشاء الطريقة المثلى لتوصيل الدواء لمعالجة قضايا الجهاز العصبي اللاإرادي والمحيطي. يعد العلاج باستبدال الجينات القائم على النواقل أحد التقنيات الناشئة في العلاج الجيني. يعد تطبيق ناقل الفيروس المرتبط بأدينو أحد الخيارات المحتملة المتاحة الآن. تم استخدام AAV9 على نطاق واسع في أبحاث العلاج الجيني لتوصيل الجين المعني بالجهاز العصبي المركزي والمحيطي. لا يتوفر لدى الباحثين خيارات كافية لتوصيل عوامل الأدوية مباشرة إلى الجهاز العصبي المحيطي. هناك حالات تنطوي على اضطرابات عصبية ناتجة عن الجهاز العصبي المحيطي أو الجهاز العصبي اللاإرادي. ومع ذلك، هناك نقص في طريقة فعالة لإيصال المخدرات لمعالجة تلك الحالات.

توضح هذه الطريقة طريقة لتوصيل عوامل الأدوية مباشرة إلى الأعصاب المبهمة لمعالجة مشكلة الجهاز العصبي اللاإرادي في الدراسات قبل السريرية باستخدام الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصدير هذه الطريقة لتوصيل الأدوية عبر الأعصاب الطرفية الأخرى مع التعديلات اللازمة في الأنواع الأخرى. سيواصل المختبر الرمادي أبحاث العلاج الجيني قبل السريري بوساطة AV باستخدام كل من القوارض الكبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، ركزنا على تطوير طرق جديدة قابلة للتطبيق لتمهيد استراتيجية العلاج ببدائل الجينات.

[الراوي] للبدء ، قم بتوصيل حقنة زجاجية سعة 100 ميكرولتر مع إزالة المكبس بإبرة قياس 27. قم بتوصيل أحد طرفي ما يقرب من 45 سم من أنابيب البولي إيثيلين المعقمة بإبرة قياس 27 ، ثم قم بتركيب حقنة بلاستيكية سعة ثلاثة ملليلتر بإبرة قياس 27 ، وقم بتحميل المحقنة بحوالي 0.5 مل من محلول ملحي عادي بنسبة 0.9٪. استخدم محلول ملحي عادي بنسبة 0.9٪ لملء أنبوب البولي إيثيلين من الطرف المفتوح ، مما يضمن الطول الكامل للأنبوب ، ويتم ملء برميل المحقنة الزجاجية حتى يفيض المحلول الملحي. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإزالة وتجاهل المحقنة التي يبلغ حجمها ثلاثة ملليلتر وإبرتها. الآن أدخل المكبس في برميل المحقنة الزجاجية ، وادفعه للأمام قليلا إلى منتصف البرميل ، ثم ضع المحقنة الزجاجية في مضخة المحقنة. استخدم مضخة الحقنة لسحب المكبس للخلف قليلا ، مما يخلق مساحة هوائية تبلغ حوالي 1.5 سم في الطرف المفتوح للأنبوب. ماصة ما لا يقل عن خمسة ميكرولترات من الصبغة ، وخليط الدواء المرشح باستخدام ماصة دقيقة سعة 10 ميكرولتر على قطعة معقمة من الأغشية الصغيرة. اسحب خليط الدواء المرشح إلى الأنبوب بمساعدة مضخة الحقنة ، وحدد مستوى خليط الحقن بعلامة. قم بتركيب إبرة قياس 35 على الأنبوب ، وثبتها على سطح نظيف في المرحلة الجراحية بشريط لاصق ، مع التأكد من بقائها ثابتة ومعقمة وعدم لمس أي شيء آخر. ابدأ مضخة الحقنة لمدة 10 إلى 15 ثانية حتى يبدأ محلول الحقن في الخروج من طرف الإبرة. انقل الجرذ المخدر إلى طاولة مجهزة لإزالة الشعر وإعداد الموقع. ضع مرهما اصطناعيا للدموع في كلتا عيني الفئران لمنع الجفاف المفرط. قم بإدارة المسكنات وفقا لبروتوكول المؤسسي المعتمد للسيطرة على الألم عندما يستعيد الجرذ وعيه. حلق الجانب البطني من الرقبة في منطقة عنق الرحم ، وتمديده حتى حوالي سنتيمترين عموديا من خط الوسط على كلا الجانبين من الذقن إلى القص. تعقيم المنطقة المحلوقة ثلاث مرات مع 70٪ كحول إيثيلي و 10٪ بيتادين ، ومسح للخارج في نمط دائري. انقل الجرذ إلى المرحلة الجراحية في وضع ضعيف تحت المجهر التشريح. تأكد من تلطيف وسادة التسخين الموجودة أسفل الجرذ بشكل مناسب ، واضبط المجاهر المركزة لتصور منطقة عنق الرحم للجراحة. اربط الفئران أو أسنان الفك بخياطة غير قابلة للامتصاص. قم بإصلاح الطرف المفتوح للخياطة داخل مخروط الأنف للحفاظ على فتحتي الأنف داخل مخروط الأنف طوال فترة التخدير. ضع الجرذ بحيث يقع رأسه على الجانب الأيسر من الجراح الأيمن. ضعي وسادة شاش معقمة تحت الرقبة لمحاذاة منطقة عنق الرحم وتقويمها. قم بتغطية جسم الجرذ بستارة معقمة ، تاركا منطقة الجراحة مكشوفة. قم بإصلاح أربعة دبابيس ضام مع مثبتات مغناطيسية في الزوايا الأربع للمرحلة الجراحية. الآن ، قم بحقن مخدر موضعي في خط الوسط لمنطقة عنق الرحم حيث سيتم إجراء الشق. استخدم شفرة مشرط لعمل شق جلدي طولي بطول سنتيمترين عند خط الوسط بين الذقن والقص في منطقة عنق الرحم البطنية. ثم مع أطراف قطنية معقمة ، يفصل بشكل حاد حواف الجلد المقطوعة. باستخدام أطراف الضام، اسحب حواف الجلد المنفصلة في اتجاهين متعاكسين. افصل اللفافة باستخدام أطراف قطنية للتعمق أكثر ، وادفع الغدد اللعابية بشكل جانبي. الآن ، افصل عضلات القص الخشائية بأطراف قطنية وسحبها بشكل جانبي باستخدام دبابيس ضام. استمر في فصل الأنسجة على الجانب الأيسر من القصبة الهوائية حتى يظهر غمد الشريان السباتي. استخدم ملقطا دقيقا لإحداث ثقب صغير في غمد الشريان السباتي دون الإضرار بالشريان السباتي ، وافصل بعناية العصب المبهم الأيسر عن الشريان السباتي المشترك. بمجرد فصل العصب عن الشريان باستخدام الملقط ، استخدم إبرة منحنية قياس 25 مثبتة على حقنة سعة مليلتر واحد للربط ، وامسك العصب باليد غير المهيمنة. امسك الإبرة المحملة بخليط صبغة الدواء المرشح باليد المهيمنة. لتسهيل الوخز السلس ، حافظ على استقامة العصب عن طريق سحبه برفق باستخدام خطاف قياس 25. أدخل الإبرة في العصب ، ودفعها للأمام بأكثر من 0.5 سم مع الحفاظ على الإبرة موازية للعصب المبهم. اسحب للخلف قليلا بحيث يبقى ما يقرب من 0.4 إلى 0.5 سم من الإبرة داخل العصب. قلل من عدد وخز الأعصاب بإبرة واحدة إلى ما لا يزيد عن ثلاث مرات. بعد التأكد من إدخال الإبرة ، احتفظ بموضعها دون حركة ، وقم بتشغيل مضخة المحقنة. راقب التسريب للتأكد من بقائه داخل العصب ويتدفق بسلاسة. استخدم النقطة المحددة على أنبوب التسريب لتتبع حركة خليط صبغة الدواء. لاحظ عندما يبدأ العصب في تطوير لون الصبغة. قم بإزالة الإبرة المنحنية قياس 25 ، وباستخدام أطراف قطنية معقمة ، انقل الأنسجة برفق إلى وضعها الأصلي. ثم قم بإزالة أطراف الضام. أغلق الجرح بخياطة قابلة للامتصاص أو غير قابلة للامتصاص ، وقم بتطبيق كمية صغيرة من غراء الأنسجة بين الغرز إذا لزم الأمر لضمان إغلاق الجرح بشكل مثالي.