تحليل تعبير الجينات المسرطنة مع التغيرات في الأس الهيدروجيني في خط خلايا قنية البنكرياس

في مستشفيات AIG ، نحقق في كيفية تأثير انخفاض إفرازات الأقنية البنكرياس وانخفاض درجة الحموضة على التعبيرات الجينية في خلايا الأقنية البنكرياس ، مع التركيز بشكل خاص على الجينات المسرطنة ، واستكشاف إمكانية التكيف الخلوي مع البيئات الدقيقة الحمضية. التحدي هنا هو عدم تجانس أورام البنكرياس ، مما يعقد العلاج وكذلك الأساليب التجريبية. لذلك أجرينا تحليل RNAC لخلايا الأقنية البنكرياس في ظل ظروف الأس الهيدروجيني المنخفض ، ووجدنا أن هناك زيادة في التعبير عن ثلاثة جينات مسرطنة تسلط الضوء على الروابط المحتملة بين البيئة الحمضية وتعبير الجينات المسرطنة في خلايا قناة البنكرياس.

سلطت دراستنا الضوء على تعبير الجينات المسرطنة في ظل ظروف الأس الهيدروجيني المنخفض ، ويمكن لهذا النظام أن يعزز بحثنا في دراسة السرطان الغدي الأقنية في البنكرياس في ظل ظروف الالتهاب. لذا فإن النطاق المستقبلي لهذه الدراسة هو تقييم دور زيادة تعبيرات الجينات المسرطنة في بدء الأورام في ظل الظروف الالتهابية ، كما هو الحال في التهاب البنكرياس المزمن. للبدء ، قم بشراء خط الخلايا القنوية البنكرياسية الطبيعي للإنسان.

قم بإذابة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حمام مائي. الآن قم بتصفية الوسط الكامل المحضر حديثا من خلال مرشح حقنة. أضف ستة ملليلتر من الوسط الكامل إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل.

ثم انقل معلق الخلية المذاب إلى الأنبوب واخلطه جيدا. الطرد المركزي التعليق عند 1 ، 800 جم لمدة ست دقائق. تخلص من المادة الطافية وأضف ملليلترا واحدا من وسط الاستزراع إلى الحبيبات قبل الخلط برفق.

بعد ذلك ، أضف أربعة ملليلتر من الوسط الكامل إلى طبق بتري 60 ملم. ثم قم بسحب تعليق الخلية بالتنقيط في القارورة. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية تحت مكملات ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.

لتغيير الرقم الهيدروجيني لوسط الاستزراع ، قم أولا بإعداد 100 مل من محاليل مخزون فوسفات الصوديوم 0.5 مولار بقيم الأس الهيدروجيني 6.0 و 6.5 و 7.0. تحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني واضبطه باستخدام حمض هيدروكلوريك مولار أو هيدروكسيد الصوديوم المولاري. ثم قم بتصفية وتعقيم المخازن المؤقتة في غطاء تدفق الهواء الرقائقي باستخدام مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر.

بعد ذلك ، أضف 20 مل من المخزن المؤقت لفوسفات الصوديوم المعقم 0.5 مولار من الرقم الهيدروجيني المعني إلى 80 مل من وسط الثقافة لتحضير وسائط ذات درجة حموضة مختلفة. أضف الوسائط ذات الرقم الهيدروجيني المتغير إلى 85 إلى 90٪ من خلايا الأقنية البشرية المتقاربة. لاحظ التغيرات المورفولوجية تحت مجهر المجال الساطع على فترات ساعة واحدة لمدة ست ساعات.

لعزل الحمض النووي الريبي عن الثقافة ، قم أولا بشفط وسط الثقافة واشطف الخلايا بمليلتر واحد من PBS. ضع الطبق 60 ملم على الثلج ، ثم ملليلتر واحد من PBS على الطبق 60 ملم واكشط الخلايا باستخدام مكشطة الخلية. الآن انقل التعليق إلى أنبوب جديد.

قم بالطرد المركزي عند 8 ، 000 جم لمدة 10 دقائق وتخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، أضف 600 ميكرولتر من محلول التحلل الذي يحتوي على بيتا ميركابتو إيثانول إلى الحبيبات. ماصة التعليق لأعلى ولأسفل لمدة خمس إلى 10 دقائق على الجليد.

أضف حجما متساويا من 70٪ من الإيثانول إلى المحللة وقم بربط المعلق جيدا. انقل المحلول إلى عمود غشاء السيليكا. ثم قم بالطرد المركزي للعمود عند أكثر من 8 ، 000 جم لمدة 30 ثانية وتخلص من التدفق من خلاله.

بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى العينة وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى. قم بالطرد المركزي للأنبوب الفارغ لمدة دقيقة واحدة بأكثر من 8 ، 000 جم ، وأخيرا ، أضف 30 إلى 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى العمود. بعد حضانة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بالطرد المركزي للعمود مرة أخرى بسرعات أعلى من 8 ، 000 جم لمدة خمس دقائق.

لوحظ انخفاض كبير في حجم الخلية وانكماش خلايا الدكتايل في الوسط الحمضي مقارنة بالخلايا المحفوظة في وسط طبيعي. حدثت التغييرات الأكثر وضوحا في موت الخلايا بعد ست ساعات من الحضانة مع انخفاض إضافي في عدد الخلايا وعلامات الإجهاد الخلوي في 22 ساعة. كان عدد الجينات المنظمة أعلى عند درجة الحموضة 6.5 مع 148 جينا تليها الرقم الهيدروجيني سبعة مع 109 جينات ودرجة الحموضة ستة مع 90 جينا.

كانت الجينات منخفضة التنظيم أقل مع 20 عند درجة الحموضة السادسة و 14 عند الرقم الهيدروجيني 6.5 و 23 عند درجة الحموضة السابعة. تم تنظيم ثلاثة جينات ورمية ، LCK ، FGR و ASAP ثلاثة عبر جميع مستويات الأس الهيدروجيني المختبرة ، مما يشير إلى دور في تكاثر الخلايا في ظل الظروف الحمضية.