عزل واستزراع الخلايا الشحمية الأولية في الفئران من الفئران الخالية من الدهون والسمنة

يركز بحثنا على التحقيق في وظيفة الخلايا الشحمية الناضجة من مستودعات الدهون المختلفة والظروف الغذائية. نحن مهتمون بشكل خاص بفهم كيفية تواصل الخلايا الشحمية الناضجة مع الخلايا المحيطة وكيف يمكن أن يؤثر هذا الحديث المتبادل على تطور المرض وتغييره في السمنة. الخلايا الشحمية الناضجة هي خلايا كبيرة وحساسة ، مما يجعل طرق عزل الخلايا شائعة الاستخدام مثل FACS غير فعالة.

علاوة على ذلك ، يمكن أن تكون المستويات العالية من الدهون الحرة الموجودة غالبا في الأنسجة الدهنية سامة للخلايا الشحمية الناضجة مما يعقد صيانتها. على عكس الأساليب شائعة الاستخدام التي تعتمد على التمايز في المختبر للخلايا الشحمية ، يسمح لنا هذا البروتوكول بدراسة الخلايا الشحمية المعزولة خارج الجسم الحي ، والتي تشبه الخلايا الشحمية في الجسم الحي وظيفيا ونسخيا. هذا مهم بشكل خاص لأن الخلايا الشحمية تختلف اختلافا كبيرا بين مستودعات الدهون وفي ظروف النظام الغذائي المختلفة.

يعزل هذا البروتوكول بكفاءة ، ويعكس الخلايا الشحمية الناضجة ويمكن تطويره بسهولة. يتم تضمين التعديلات لتحسين عزل الخلايا الشحمية عن الفئران من مختلف الجنسين والظروف الغذائية المختلفة. بمجرد عزلها ، يمكن استزراع الخلايا الشحمية أو تصويرها أو استخدامها حسب الحاجة.

للبدء ، قم بإعداد محلول كولاجيناز مع DNase عن طريق إضافة 0.00017 جرام من DNase لكل مليلتر واحد من محلول الكولاجيناز ، وقم بتدوير الخليط لضمان الخلط الكامل. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بفرم الأنسجة الدهنية للفئران المعزولة حتى تبدو متجانسة. ثم انقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلترا.

أضف محلول الكولاجيناز المحضر ومحلول DNase إلى الأنسجة الدهنية المفرومة والدوامة بأقصى سرعة لمدة سبع إلى 10 ثوان لخلط المكونات جيدا. ثم ضع الأنابيب المخروطية سعة 50 مليلتر أفقيا في شاكر مضبوطة على 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، قم بإزالة الأنابيب ، والدوامة لمدة خمس ثوان وفحص العينات.

الآن باستخدام ماصة مصلية ، قم بتمرير الأنسجة المهضومة عبر غربال إلى أنبوب مخروطي جديد معقم سعة 50 ملليلترا. أضف FBS يساوي حجم الأنسجة ومحلول الكولاجيناز من خلال المنخل في نفس الأنبوب المخروطي لتحييد الكولاجيناز. قم بتدوير الأنابيب عند 300 جم لمدة ثلاث دقائق عند درجة الحرارة المحددة في الجدول الموضح هنا.

ثم باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، تخلص بعناية من الطبقة العليا من الدهون الحرة. بعد ذلك ، استخدم ماصة P1000 مع قطع الطرف لنقل الخلايا الشحمية الناضجة إلى أنبوب معد سعة 15 مليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من وسائط النمو. اقلب برفق الأنابيب سعة 15 ملليلتر التي تحتوي على خلايا شحمية ناضجة ثلاث إلى خمس مرات حتى تنتشر الطبقة البيضاء في جميع أنحاء الوسائط.

بعد إراحة الأنابيب لمدة 10 دقائق ، قم بتدويرها عند درجة الحرارة المحددة مسبقا لفصل الطبقات بشكل أكبر. بعد ذلك ، استخدم ماصة للتخلص من الطبقة العليا من الدهون الحرة. الآن نعلق 21 إبرة قياس إلى حقنة خمسة ملليلتر وحرك الإبرة بعناية أسفل حافة الأنبوب حتى يكون الجزء السفلي من الإبرة أسفل طبقة موقع الخلايا الشحمية الناضجة.

ثم اسحب المحقنة ببطء لإزالة وسائط الثقافة وأي حطام خلوي. أضف برفق 10 ملليلتر من وسائط الثقافة إلى الأنبوب. باستخدام أطراف ماصة تحميل الهلام حرك الطرف لأسفل حافة الأنبوب لإزالة الوسائط المتبقية من أسفل طبقة الخلايا الشحمية الناضجة.

ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 100 جم لمدة دقيقة واحدة. باستخدام ماصة ، قم بإزالة الدهون الحرة. باستخدام طرف ماصة تحميل الهلام، قم بإزالة وسائط المزرعة الموجودة أسفل الخلايا الشحمية.

قم بإزالة إدخالات مزرعة الخلايا من صفيحة 24 بئرا معالجة بزراعة الأنسجة وضعها على سطح الغطاء. املأ الآبار المتناوبة من اللوحة بوسائط ثقافة دافئة. باستخدام طرف ماصة P200 مقطوعة، انقل 30 ميكرولترا من الخلايا الشحمية الناضجة المعبأة إلى الجزء العلوي من ملحق Transwell.

ثم التقط حشوة Transwell بحذر ، واقلبها ، وضعها في بئر مملوء مسبقا في اللوحة المكونة من 24 بئرا. لإزالة الوسائط من الآبار، أمسك إدراج Transwell بثبات والشفق باستخدام ماصة P200 من خلال الفتحات الصغيرة على الجانبين. بعد إزالة الوسائط ، مع الاستمرار في تثبيت Transwell في مكانه ، أضف ببطء ملليلترا واحدا من الوسائط الجديدة على طول الجدار الجانبي للبئر.