قياس قياس التدفق الخلوي عالي الإنتاجية للنمط الميكانيكي الخلوي بناء على تمزق وتوصيل مجسات توتر الحمض النووي إلى الخلايا

يدرس مختبرنا بشكل عام الآليات الجزيئية التي تستخدمها الخلايا لنقل المحفزات الميكانيكية. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتطوير طرق عالية الإنتاجية لقياس القوى التي تمارسها الخلايا على محيطها لجلب علم الأحياء الميكانيكي إلى عصر omics. تشير الدراسات إلى تورط القوى الميكانيكية في كيفية تنشيط الخلايا التائية بواسطة المستضد الصحيح وكيف تتمايز الخلايا الجذعية إلى أنواع خلايا متخصصة.

في الآونة الأخيرة ، أدت عمليات الاستهداف الكامنة وراء ميكانيكا الخلايا غير المنظمة إلى تطوير الميكانيكيين الميكانيكيين كوسيلة لعلاج المرض. تقيس مستشعرات الحمض النووي المزدوج ودبوس الشعر القوى خارج الخلية ، بينما تسمح المستشعرات المشفرة وراثيا بالقياسات داخل الخلايا. تتطلب جميعها تقريبا مجاهر متطورة.

يمكن للفحص المجهري لقوة الجر قياس القوة التي تمارسها الخلايا على محيطها ، ولكنه أيضا يتضمن تصويرا عالي الدقة. نتعامل مع ثلاثة تحديات في هذا المجال في هذا العمل ، أحدهما ، باستخدام قياس التدفق الخلوي لقياس القوة بدلا من التصوير ، والثاني ، استخدام تقنية علامة HOH لربط الروابط والأجسام المضادة بمجسات الحمض النووي ، والثالث ، باستخدام لوحات زراعة الخلايا القياسية بدون معالجات سطحية خاصة. كيف يمكن استخدام التغييرات في القوى المتولدة للخلايا كعلامة تنبؤية لحالة المرض ، وهل تساهم هذه القوى في ، أم أنها تأثير ثانوي لحالة المرض المذكورة؟

للبدء ، قم بتجميع الطباعة على الوجهين بنسبة 1.1 إلى مولية واحدة من حبلا المرساة مع التبريد إلى خيط الترابط مع الفلوروفور. تحضير الطباعة على الوجهين بتركيز نهائي من 40 خيوط ترابط ميكرومولار في المحلول. لتلدين الدوبلكس المجمعة ، قم باحتضانها عند 98 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

ثم اترك الخليط يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة بعيدا عن الضوء. تفاعل مع الطباعة المزدوجة الملدنة مع HUH باستخدام تركيز الخيط الأقل وفرة من خطوة التلدين ، والتي في هذه الحالة ، هي حبلا الترابط. امزج الدوبلكس مع HUH بنسبة واحد إلى اثنين من المولار بتركيز نهائي من 10 ميكرومولار مزدوج و 20 ميكرومولار HUH.

احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في جهاز تدوير حراري أو كتلة حرارية محمية من الضوء. بعد الحضانة ، قم بإزالة التفاعل من الحرارة واستخدم جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة لتدوير حبال مقياس التوتر المجمعة الآن ، أو TGTs. عندما تلتصق TGTs بشكل كاف ، اغسل الآبار بالخلايا المرغوبة ثلاث مرات باستخدام PBS.

اتبع ذلك بغسلتين باستخدام وسائط خالية من المصل واترك الوسائط في الآبار بعد الغسيل النهائي. أضف 200 ميكرولتر من PBS إلى الآبار الطرفية للتخفيف من تأثيرات الحافة. انقل الطبق إلى حاضنة 37 درجة مئوية لتسخين اللوحة.

ثم استرجع الخلايا ذات الأهمية عند التقاء 80٪ تقريبا. استنشق الوسائط ، ثم اغسل الخلايا باستخدام PBS واحتضان الخلايا بالتربسين عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا ، الأمر الذي يستغرق حوالي خمس إلى 10 دقائق. بمجرد تفكك الخلايا ، أضف الحجم الأصلي لوسائط الخلية الكاملة المستخدمة للحفاظ على الخلايا.

أعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة مصلية وانقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. الطرد المركزي للخلايا عند 300 جم لمدة أربع دقائق. استنشق الوسائط وأعد تعليق الحبيبات في PBS.

بعد تكرار الطرد المركزي ، أعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من الوسائط الخالية من المصل وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. شفط الخلايا وأعد تعليقها في ما يقرب من ملليلترين من الوسائط الخالية من المصل. حدد كثافة الخلايا المعلقة لضبط التركيز حسب الرغبة.

اختياريا ، في حالة اختبار تأثيرات الدواء ، أضف التركيز المناسب للدواء إلى الخلايا وأعد الخلايا إلى الحاضنة لوقت ما قبل الحضانة قبل المتابعة. الآن ، استرجع اللوحة الأصلية من الحاضنة وقم بإزالة الوسائط المتبقية من الغسيل في الآبار التجريبية. اغسل الآبار مرة واحدة بالوسائط المرغوبة والماصة 100 ميكرولتر من الخلايا المعلقة في الآبار المرغوبة.

انقل الخلايا المطلية إلى الحاضنة لمدة 90 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بإزالة ما يقرب من 125 إلى 170 ميكرولتر من الحجم من كل بئر. إذا لزم الأمر ، اغسل الخلايا برفق باستخدام 200 ميكرولتر من PBS الدافئ.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا في كل بئر ب 50 ميكرولتر من التربسين حتى تبدأ الخلايا في الانفصال ، الأمر الذي يستغرق حوالي خمس إلى 10 دقائق. بعد ذلك ، أضف 160 ميكرولترا من مخزن التدفق المؤقت المحضر حديثا إلى كل بئر. مرر الماصة برفق لأعلى ولأسفل لفصل الخلايا.

انقل 196 ميكرولترا من معلق الخلية هذا إلى أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وأضف أربعة ميكرولترات من يوديد البروبيديوم ، واخلطه برفق. أخيرا ، ضع الأنابيب في دلو ثلج بغطاء يحجب أي ضوء وقم بقياس شدة التألق باستخدام مقياس التدفق الخلوي. أكدت بوابات قياس التدفق الخلوي عزل خلية واحدة حية ناجحة ، مما يضمن تحليلا دقيقا للنمط الميكانيكي.

قدمت بوابة التحكم السلبية ، المحددة عند النسبة المئوية 99 من مضان Cy5-A ، خط أساس لمقارنة الظروف التجريبية. أظهرت خلايا CHO-K1 المعالجة ب Y27632 انخفاضا كبيرا في النسبة المئوية للخلايا التي تتجاوز بوابة التحكم السلبية عند قص TGTs ، بينما أظهر فك ضغط TGTs انخفاضا متواضعا وغير مهم من الناحية الإحصائية. أدى فك ضغط TGTs باستمرار إلى نسبة أعلى من الخلايا تتجاوز التحكم السلبي مقارنة بقص TGTs ، مما يؤكد متطلبات القوة المنخفضة.