عزل وتحديد السلالات البكتيرية من جلد البرمائيات الأرضية

يهدف هذا البحث إلى تطوير بروتوكول فعال لجمع ميكروبات الجلد من البرمائيات البرية البرية وضمان السلامة الميكروبية أثناء التخزين والمناولة.

تشمل التحديات الرئيسية منع تلوث العينة ، والحفاظ على صلاحية الميكروبات أثناء التخزين ، وزراعة النمو البطيء لتقييم تنوع ميكروبات الجلد البرمائية بشكل كامل.

ثبت أن المحلول الملحي المعزز بالجلسرين يحافظ على سلامة ميكروبات الجلد البرمائية أثناء التخزين والمناولة ، والاستزراع البكتيري المتسق ، وتحسين استراتيجيات الحفاظ على الميكروبات للأبحاث البيئية والتكنولوجيا الحيوية.

يعالج هذا البروتوكول الافتقار إلى طرق أخذ العينات الموحدة ، ويحافظ على بكتيريا جلد البرمائيات القابلة للزراعة ويتعامل معها ، ويضمن سلامة المجتمع.

[الراوي] للبدء ، قم بتعقيم الوسط عن طريق التعقيم عند 121 إلى 134 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة. بعد التعقيم ، اترك وسط الأجار يبرد إلى حوالي 45 إلى 50 درجة مئوية. تحت غطاء التدفق الصفحي المعقم مسبقا ، اسكب الوسط المبرد في أطباق بتري المعقمة. بمجرد أن يتجمد الأجار ، قم بتسمية أطباق بتري بالنوع المتوسط وتاريخ التحضير. امزج العينة التي تم الحصول عليها من الحقل مع المحلول عن طريق دفع المسحة على جدران الأنبوب أثناء الضغط على الأنبوب وتدوير المسحة جيدا ، 10 مرات في اتجاه عقارب الساعة و 10 مرات عكس اتجاه عقارب الساعة. امزج العينة الميكروبيولوجية جيدا قبل المعالجة. تحضير التخفيف التسلسلي للعينة الجلدية بمحلول ملحي يتراوح من 10 إلى قوة -1 إلى 10 إلى قوة -6. تلقيح 100 ميكرولتر من العينة غير المخففة والتخفيف التسلسلي على ألواح الأجار المحضرة. باستخدام حلقة معقمة على شكل حرف L ، قم بربط العينة عبر سطح وسط أجار ، مما يضمن التوزيع المتساوي دون ممارسة ضغط مفرط. اقلب الألواح الملقحة وضعها داخل حاضنة مثبتة على درجة حرارة 20 إلى 25 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام لدعم نمو البكتيريا المتوسطة والمؤثرات العقلية على جلد البرمائيات. بعد الحضانة ، حدد مستعمرات بكتيرية ذات أشكال مميزة لمزيد من التحليل. تأكد من أن المستعمرات معزولة جيدا وتظهر مظاهر مختلفة ، مثل الاختلافات في اللون أو الحجم أو الشكل أو الحافة أو السطح أو الملمس. للاستزراع الفرعي للمستعمرات المختارة ، قم بنقل مستعمرة معزولة جيدا من صفيحة الأجار الأصلية إلى صفيحة أجار جديدة باستخدام حلقة تلقيح في ظل ظروف معقمة. خط المستعمرة لعزلها. ثم احتضنها بشكل مناسب. يتم هنا عرض إجراء أخذ العينات المنسق لفرد speleomantes italicus باستخدام أدوات معقمة في بيئة ميدانية. تم إجراء أخذ العينات من قبل اثنين من المشغلين باستخدام قفازات ومسحات معقمة لتقليل الضغط على البرمائيات وضمان الدقة أثناء المناولة. تم نقل المسحة على الفور إلى محلول ملحي يحتوي على 20٪ جلسرين للحفاظ على سلامة الميكروبات أثناء النقل إلى المختبر. تظهر هنا مقارنة بين كثافة المجتمع الميكروبي المحفوظة في محلول ملحي مع إضافة الجلسرين وبدونه. كان الحمل البكتيري في التخزين الملحي بدون الجلسرين أقل بكثير من المحلول الملحي مع الجلسرين. أظهر المجتمع الميكروبي المخزن في محلول ملحي مع الجلسرين حمولة بكتيرية مماثلة للتحكم ، مما يشير إلى الحفاظ على سلامة الميكروبات. لوحظ أفضل حفظ للمجتمع الميكروبي في محلول ملحي مع الجلسرين المخزن عند أربع درجات مئوية ، مما يدل على الحمل البكتيري الأكثر استقرارا بمرور الوقت. أدى التخزين في محلول ملحي وحده في درجة حرارة الغرفة إلى أعلى نمو بكتيري ، مما يشير إلى التلوث الميكروبي أو الترويج الانتقائي لمجموعات بكتيرية معينة. أدى التجميد عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر إلى تقليل الحمل البكتيري ، مما يشير إلى أن درجات الحرارة المنخفضة أثرت سلبا على بقاء الميكروبات.