تحليل المجموعات السكانية الفرعية للصفائح الدموية عن طريق قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان

يستخدم بحثنا قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان لتحديد وتوصيف المجموعات السكانية الفرعية للصفائح الدموية ، بهدف فهم الأدوار وأنماط التنشيط والأهمية السريرية في التخثر والالتهاب والسياق الخاص بالمرض. مكن الاختبار الخلوي متعدد الألوان القائم من مراقبة ناهض الصفائح الدموية إلى نمط تنشيط مميز ومقارنة بالببتيد المرتبط بالكولاجين يولد مادة تخثر الدم والسكان الفرعيين. يتيح الاختبار متعدد الألوان القياس المتزامن لتنشيط الصفائح الدموية والالتصاق والتجميع وإمكانات موت الخلايا المبرمج لصفائح دموية واحدة داخل مجموعة من الصفائح الدموية البشرية المعزولة في أنبوب واحد.

[مدرب] للبدء ، قم بإعداد جميع الكواشف المطلوبة لهذا الإجراء. الآن ، امزج 10 ملليلتر من 10x عازلة Tyrode مع 90 مل من الماء المقطر. أضف 0.1 جرام من الجلوكوز واضبط درجة الحموضة للحجم الكامل باستخدام الهبلز لتصل إلى 7.4. أولا ، اضبط الرقم الهيدروجيني البالغ 10 ملليلتر من المخزن المؤقت على 7.4 ، ثم اضبط الرقم الهيدروجيني ل 90 ملليلترا المتبقية مع حمض هيدروكلوريك عادي واحد على 6.5. لجمع عينات الدم ، قم بإعداد حقنة 10 ملليلتر لكل متبرع مع ملليلترين من مضادات التخثر ACD. دع المحقنة تتوازن في درجة حرارة الغرفة. بعد جمع دم المتبرع في حقنة ACD مسخنة مسبقا ، قم بنقل الدم المعالج ب ACD ببطء إلى أنبوب تفاعل سعة 15 ملليلترا. جهاز طرد مركزي عالج ACD الدم عند 209 جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون استخدام الكسر. في هذه الأثناء ، قم بإعداد 25 مل من محلول Tyrode's Hepes ، الرقم الهيدروجيني 6.5 في أنبوب تفاعل سعة 50 مل. بعد الطرد المركزي ، انقل طبقة البلازما الغنية بالصفائح الدموية العلوية برفق إلى الأنبوب الذي يحتوي على عازلة Tyrode's Hepes. لمنع التلوث ، اترك ما يقرب من ملليلتر واحد من البلازما الغنية بالصفائح الدموية فوق طبقة كريات الدم الحمراء وطبقة كريات الدم الحمراء. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للتعليق عند 430 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لحبيبات الصفائح الدموية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الصفائح الدموية بعناية في 200 إلى 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتيرود ، مع تعديلها على درجة الحموضة 7.4. قم بقياس عدد الصفائح الدموية باستخدام عداد الخلايا قبل تعديله على 200,000 صفيحة لكل ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت Tyrode's Hepes عند الرقم الهيدروجيني 7.4. بالنسبة للمستقبلات التي لا تتطلب التنشيط قبل التلوين ، بما في ذلك CD61 و CD42B و CD41 و CXCR7 و CXCR4 ، قم بإعداد عينة واحدة غير ملوثة وعينة واحدة ملطخة لكل جسم مضاد. للمستقبلات أو العلامات التي تتطلب التنشيط مثل PAC-1 و CD63 و CD62P و NXN5 و zombie NIR. قم بتنشيط العينة ب 10 ميكروغرام لكل مليلتر من CRPXL وقم بإعداد عينات منشطة وغير منشطة. لتنشيط الصفائح الدموية ، احتضنها ب 10 ميكروغرام لكل مليلتر من CRPXL لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، احتضان الصفائح الدموية المعزولة بتركيزات متفاوتة من الجسم المضاد المترافق الفلوروكروم أو تموت لمدة 30 دقيقة. ثم أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت المرتبط بالأنيكسين إلى كل عينة لتخفيفها. قم بقياس 10,000 حدث لكل عينة باستخدام مقياس التدفق الخلوي. احسب مؤشر البقعة لكل جسم مضاد لتحديد الفصل الأمثل بين المجموعات السكانية الإيجابية والسلبية. ارسم مؤشر البقع مقابل تركيزات الأجسام المضادة لتحديد التركيز الأمثل لكل جسم مضاد للتلوين ، قم بإذابة مسحوق الهيمين في 1.4 متر من هيدروكسيد الصوديوم لإنشاء محلول 3M. سخني المحلول إلى 96 درجة مئوية لمدة خمس دقائق بمعدل 450 دورة في الدقيقة. قم بتخفيفه بالماء المقطر للحصول على محلول ساق ثلاثة ملليمول. بعد ضبط عدد الصفائح الدموية إلى 1 مليون صفيحة لكل عينة ، قم بتنشيط الصفائح الدموية كما هو موضح سابقا. أضف 43.3 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة إلى كل عينة واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد الحضانة ، قم بتخفيف كل عينة ب 300 ميكرولتر من واحد X و X في مخزن مؤقت ملزم يتكون من 10 ملليمولار هيدروكسيد الصوديوم Hepes عند درجة الحموضة 7.4. قم بقياس كل عينة ملطخة على الفور باستخدام مقياس التدفق الخلوي. للتعويض بالخرز ، قم بإعداد 150 ميكرولترا من PBS لكل فلوروفور وأضف قطرة واحدة من الخرز وميكرولتر واحد من الجسم المضاد المترافق الفلوري. للتعويض عن الملحق V ، استخدم PECY7B سبع حبات مصنفة بقرص مضغوط مضاد للإنسان 62L مقترن بنفس الفلوروفور مثل الملحق V. استخدم حبات تعويض أمين التفاعلية لصبغة Amine التفاعلية عن طريق خلط قطرتين من الخرز الموجب وقطرة واحدة من الخرز السالبة في 150 ميكرولتر من PBS مع ميكرولتر واحد من القالب. تأكد من أن الخرزات الموجبة تتفاعل وتعرض إشارة وأن الخرزات السالبة لا تتفاعل. قم بإعداد مضان ناقص عنصر تحكم واحد لكل علامة. أظهرت مخططات المبعثر تحولا واضحا في أعداد الصفائح الدموية. مع تشكيل الهمين المزيد من الصفائح الدموية ذات التشتت الأمامي المنخفض من الناهضات الأخرى. أدى العلاج بالثرومبين ADP و CRPXL إلى 40 إلى 60٪ من الصفائح الدموية CD42 إيجابية ، بينما قلل الهيمين بشكل كبير من هذه المجموعة. لم يكن لجميع ناهضات الصفائح الدموية أي تأثير على التعبير السطحي CD41 و CD61. فقط الهمين زاد بشكل كبير من التعبير السطحي CXCR4 و CXCR7. بالإضافة إلى ذلك ، تم تعزيز التعرض للفوسفاتيديل سيرين أيضا تحت معالجة الهمين ، مما أدى إلى تعزيز الخلايا الإيجابية للملحق الخامس. حددت تحليلات UMAP و phenol graph 27 مجموعة صفائح دموية مميزة ، والتي تختلف باختلاف نوع ناهض. تسبب هيمين في التحول الأكثر دراماتيكية في أنماط العنقود. تم الحفاظ على المجموعات السكانية الفرعية للصفائح الدموية المريحة مع ADP وتم تأجيرها بالهيمين.