دراسة موت الخلايا المبرمج الناجم عن الجسيمات النانوية للنحاس في البكتيريا

يبحث هذا البحث في فعالية مبيد الجراثيم النانوية للنحاس ضد ثلاث بكتيريا شائعة ذات أهمية سريريا. يستكشف الحالات بما في ذلك توليد ROS والمشاركة المحتملة لموت الخلايا المبرمج.

يتمثل أحد التحديات الحالية في تحقيق عدد ثابت من المستعمرات. أعتقد أن هذا ينبع من التدخل. ينبع تحديث الخلايا أثناء التخفيف من العد المزيف مع الموقع مقارنة بالعد الأكثر خبرة.

كانت مجموعتنا أول من استخدم معدل الخلايا لدراسة آليات مبيد الجراثيم لجسيمات النحاس النانوية ، مما يكشف عن أن الموت البكتيري ينطوي على عمليات خلوية مثل توليد ROS والالتهام الذاتي.

يعالج البروتوكول الحاجة إلى فهم أعمق للآلية التي تقتل بها جزيئات النحاس النانوية البكتيريا ، مع التركيز بشكل خاص على المنطقة غير المستكشفة لمسارات موت الخلايا المبرمجة البكتيرية.

باستخدام معدلات الخلايا المختلفة ، أكدنا أن الموت البكتيري الناجم عن الجسيمات النانوية النحاسية ينطوي على الالتهام الذاتي والحمل الزائد ل ROS وحددنا المسارات الرئيسية المدعومة بتجارب موثوقة قائمة على ثلاث نسخ مع تصميم بسيط

[الراوي] للبدء في الحصول على مساحيق النحاس النانوية التجارية بأقطار 25 نانومتر و 60 إلى 80 نانومتر من مورد تجاري. استخدم ملليلتر واحد من SDS مليمولار واحد كمشتت لكل حجم جسيم نانوي. ثم قم بتفريق الجسيمات النانوية باستخدام حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احصل على سلالات الإشريكية القولونية و Acinetobacter baumannii و Staphylococcus aureus من مراكز الموارد البيولوجية المعنية. استزراع كل بكتيريا في 10 مل من مرق LB في ظل ظروف هوائية عند 37 درجة مئوية. تمييع المزارع البكتيرية في وسط LB لتصل إلى كثافة بصرية تبلغ حوالي 0.5 عند 600 نانومتر. استخدم الآن محاليل جزيئات النحاس النانوية لإعداد مجموعة من التركيزات بين صفر إلى 100 ميكروغرام لكل مليلتر من كلا الحجمين. ماصة 500 ميكرولتر من المزارع البكتيرية في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة وأجهزة الطرد المركزي عند 3,300 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد سحب العينة الطافية ، أضف تركيزات مختلفة من كلا الحجمين من الجسيمات النانوية إلى كل أنبوب. تعامل مع مجموعات التحكم التي تحتوي على 500 ميكرولتر من PBS كعنصر تحكم سلبي و 500 ميكرولتر من الكحول بنسبة 70٪ كعنصر تحكم إيجابي. ثم احتضان جميع العينات مع الرج بسرعة 200 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة ، اغسل البكتيريا باستخدام PBS وانشرها على ألواح LB أجار. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، عد المستعمرات على كل لوحة لجميع مجموعات العلاج. عالج البكتيريا بخمسة ميكرومولار SBI لمدة ساعتين ، أو 0.5 ميكرومولار نيكروسلفوناميد لمدة ساعة واحدة ، أو 100 نانومولار نبتمان لمدة 30 دقيقة ، أو 100 نانومولار Z-VAD لمدة 30 دقيقة. بعد اكتمال جميع المعالجة المسبقة ، قم بالطرد المركزي لجميع الأنابيب عند 3,300 جم لمدة 10 دقائق. ثم أعد تعليق الحبيبات في 800 ميكرولتر من PBS لغسل معدل المعالجة المسبقة. توزيع الكريات المعلقة. جهاز الطرد المركزي لكل أنبوب ، ثم تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الكريات في مخاليط معدل الجسيمات النانوية قبل احتضانها بالتحريض. أضف الآن 70٪ من الإيثانول و PBS كعناصر تحكم إيجابية وسلبية. قم بتضمين مجموعات تحكم فارغة معالجة بمثبطات ، ولكن بدون جسيمات نانوية. بعد الحضانة ، قم بعمل كاشف قابلية للحياة في الخلية بنسبة حجم واحد إلى عشرة واحتضانه. بعد الطرد المركزي للثقافات مرة أخرى ، انقل المواد الطافية إلى ألواح 96 بئرا. قم بقياس التألق عند إثارة 560 نانومتر وانبعاث 590 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة. خفف المواد الطافية المتبقية إلى 10 أس سالب خمسة و 10 أس سالب أربعة وانتشر على ألواح أجار LB إلى الثقافة. عد المستعمرات الفردية في اليوم التالي. الماصة البكتيرية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. ثم قم بتعريض الثقافات للأشعة فوق البنفسجية 405 نانومتر لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك ، احتضن الثقافات عند 45 درجة مئوية لمدة ساعتين. ثم احتضان البكتيريا عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين. بعد المعالجة الباردة ، احتضن البكتيريا في بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 30 دقيقة. حافظ على مجموعة تحكم عند 37 درجة مئوية في مرق LB. الآن عالج البكتيريا بجسيمات 20 أو 60 نانومتر بتركيزات تتراوح بين واحد إلى 100 ميكروغرام لكل مليلتر لمدة 24 ساعة. ثم اغسل البكتيريا المعالجة مرتين باستخدام PBS. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الكريات البكتيرية في محلول خمسة ميكرومولار من صبغة ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسين ثنائي الأسيتات 2 '،7 '. تحليل شدة التألق عند انبعاث 520 أو 530 نانومتر. تم تقليل عدد مستعمرات الإشريكية القولونية بشكل كبير بمقدار 20 نانومتر من جزيئات النحاس النانوية عند ميكروغرام واحد لكل مليلتر وبمقدار 60 نانومتر من جزيئات النحاس النانوية بمعدل خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر. أظهرت المكورات العنقودية الذهبية انخفاضا كبيرا في عدد المستعمرات في جميع تركيزات كلا حجمي الجسيمات النانوية. في Acinetobacter baumannii ، تطلبت التخفيضات في أعداد المستعمرات خمسة ميكروغرامات لكل ملليلتر من جزيئات النحاس النانوية 20 نانومتر و 10 ميكروغرام لكل مليلتر من جزيئات النحاس النانوية 60 نانومتر. تسببت معالجات الجسيمات النانوية النحاسية في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في جميع البكتيريا ، حيث أظهرت جسيمات 20 نانومترا أعلى أجزاء من الخلايا الموجبة بتركيزات أقل. في المقابل ، أدت معالجات الجسيمات النانوية النحاسية 60 نانومتر إلى توليد أنواع الأكسجين التفاعلية المتسقة عبر جميع التركيزات. أدى معدل موت الخلايا المبرمج Z-VAD إلى زيادة بقاء الإشريكية القولونية المعالجة بحجمي الجسيمات النانوية بتركيزات منخفضة إلى متوسطة. أدى علاج وكالة الأمن القومي إلى تحسين بقاء المكورات العنقودية الذهبية عبر جميع تركيزات الجسيمات النانوية النحاسية البالغة 20 نانومتر. أظهر Acinetobacter baumannii قابلية محسنة للحياة مع Z-VAD أقل من واحد وخمسة و 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من التعرض لجزيئات النحاس 20 و 60 نانومتر ، بينما زادت وكالة الأمن القومي من قابلية البقاء عند 10 ميكروغرام فقط لكل ملليلتر من التعرض لجزيئات النحاس النانوية 20 نانومتر.