النضوب السريع للبلاعم الكلوية باستخدام أداة استئصال الخلايا البشرية CD59 / Intermedilysin

نحن نستخدم النصبة بوساطة intermedilysin للخلية المعبرة البشرية CD59 في الفئران لدراسة تجديد الميكروفاج الكلوي ، مع التركيز على استعادة الخلية الوحيدة التي يحركها الكيموكين وإنشاء متخصصة للمراقبة المناعية بعد الإصابة. تكشف التطورات الحديثة في مجالنا عن آلية تجديد الضامة الكلوية ، مما يسلط الضوء على كيموكين معين يجند البلاعم وكيف يتم إعادة تأسيس المراقبة المناعية بعد إصابة الكلى الحادة. نحن نجمع بين علم الوراثة بالتبريد المحفز للتاموكسيفين ، واستئصال intermedilysin ، وقياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات ، والفحص المجهري داخل الحيوية لاستئصال وتتبع وتصور بلاعم الكلى في الوقت الفعلي.

تتمثل التحديات الرئيسية في تجنب الالتهاب الجهازي ، واستهداف البلاعم المقيمة فقط ، وقياس التجديد السريع دون إزعاج البيئة الكلوية الحساسة. أظهرنا أن الخلايا الوحيدة تستعيد 88٪ من بلاعم الكلى في غضون سبعة أيام بعد الاستئصال ، وهي عمليات تعتمد بشكل حاسم على محور إشارات CX3 CR1 و CX3 CL1. للبدء ، سخني زيت الذرة إلى 42 درجة مئوية.

قم بإذابة 100 ملليغرام من عقار تاموكسيفين في خمسة ملليلتر من زيت الذرة المسخن مسبقا لتحضير محلول مخزون بتركيز 20 ملليغرام لكل مليلتر. تطبيق عقار تاموكسيفين داخل الصفاق للفئران الذكور البالغة من العمر 10 إلى 12 أسبوعا بجرعة 100 ميكروغرام لكل جرام من وزن الجسم. بعد 15 يوما ، حقن جرعة وريدية واحدة من الإنترميديليسين في الفئران بجرعة 120 نانوجرام لكل جرام من وزن الجسم.

مراقبة وتأكيد استئصال البلاعم المقيمة والتجديد اللاحق عن طريق إجراء قياس التدفق الخلوي في يوم واحد وثلاثة وسبعة أيام ، بعد إعطاء الإنترميديليسين. لجمع الكلى ، استخدم ملقطا ومقصا ناعما لعمل شق أفقي في منطقة أسفل البطن للفأر الذي تم رحيمه. مد الشق عموديا على طول خط الوسط حتى أسفل القفص الصدري أو القص مباشرة.

اسحب الجلد والعضلات برفق لكشف تجويف الصدر. اقطع الأذين الأيمن مفتوحا للسماح بتصريف الدم من الدورة الدموية. أدخل إبرة قياس 21 إلى 23 في البطين الأيسر.

ابدأ التروية ب 10 إلى 20 مل من PBS البارد لطرد الدم. استمر في التروية حتى تبدو الكلى شاحبة ، مما يشير إلى تصفية الدم بشكل فعال. حدد موقع الكلى على جدار الجسم الظهري ، وافصلهما برفق عن الأنسجة المحيطة باستخدام الملقط والمقص.

استئصال كبسولات الكلى ووضع الكلى على الفور في برنامج تلفزيوني بارد لمنع التدهور. قم بإعداد 100 مل من كوكتيل إنزيم الهضم عن طريق خلط HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم والكولاجناز IV و DNase I. قم بإعداد محلول الإنزيم طازجا واحتفظ به على الثلج حتى الاستخدام. باستخدام مقص معقم ، قم بتقطيع الكلى إلى شظايا صغيرة في طبق بتري يحتوي على خمسة ملليلتر من HBSS.

انقل أنسجة الكلى المفرومة إلى أنابيب سعة 15 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلتر من محلول الإنزيم المحضر. الآن احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع تحريض لطيف لفصل الأنسجة. قم بتشويه الأنسجة برفق باستخدام ماصة أو مكبس حقنة لتفتيت كتل الخلايا بشكل أكبر.

قم بإزالة الحطام عن طريق تمرير معلق الخلية عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 700 جم لمدة 10 دقائق عند 18 درجة مئوية. بعد ذلك ، صب المخزن المؤقت بعناية.

أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من محلول التحلل قبل الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لتحلل خلايا الدم الحمراء. أضف PBS لغسل الخلايا وإزالة المخزن المؤقت للتحلل. حافظ على المعلق أحادي الخلية الناتج على الثلج حتى الاستخدام مرة أخرى.

من أجل الطرد المركزي المتدرج للكثافة ، قم أولا بتعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من محلول تدرج الكثافة 30٪. ضع هذا بحذر على ثلاثة ملليلتر من محلول التدرج عالي الكثافة بنسبة 70٪ في أنبوب الطرد المركزي. قم بالطرد المركزي للتدرج عند 500 جم لمدة 30 دقيقة دون وضع استراحة.

بعد الطرد المركزي ، اجمع بعناية طبقة الواجهة بين حلول 30٪ و 70٪. اغسل الخلايا التي تم جمعها مرتين باستخدام 10 مل من PBS ، وقم بغسل كل جهاز طرد مركزي عند 500 جم لمدة 10 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية النهائية في مليلتر واحد من مخزن FACS المؤقت في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

عد الخلايا باستخدام مقياس الخلايا الدموية تحت مجهر المجال الساطع ، واضبط تركيز الخلية على مرتين في 10 بقوة ست خلايا لكل مليلتر. قم بتدوير الخلايا في أنابيب سعة 1.5 مليلتر عن طريق الطرد المركزي عند 650 جم لمدة خمس دقائق ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من مخزن FACS. أضف الجسم المضاد للقرص المضغوط 16 أو 32 بتخفيف واحد إلى 200 لمنع ارتباط مستقبلات FC غير المحددة.

بعد احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، قم بتلطيخ الخلايا بصبغة مائية حية / ميتة وكوكتيل أجسام مضادة مترافقة ، بما في ذلك CD45 E 450 و CD11 B PE SI7 و HCD59 PE و F4 / 80 BV 605. أضف كوكتيل الأجسام المضادة مباشرة إلى معلق الخلية. احتضن العينة لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام لحماية الفلوروفورات.

ثم اغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن مؤقت FACS. ثبت الخلايا في 1٪ بارافورمالديهايد لمدة 30 دقيقة على الثلج. ثم اغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن مؤقت FACS لإزالة المثبت المتبقي.

الحصول على خلايا ملطخة وثابتة باستخدام مقياس التدفق الخلوي. تحليل البيانات باستخدام البرنامج. تحديد البلاعم المقيمة في الكلى والأنسجة الأخرى والدبقية الصغيرة باستخدام العلامات CD45 و CD11B و F4 / 80.

قم بإجراء البوابات الأولية لتحديد الخلايا الحية باستخدام ملفات تعريف التبعثر الأمامية والجانبية. تخلص من الضربات المزدوجة باستخدام منطقة التشتت الأمامية مقابل بوابات الارتفاع. استبعاد الخلايا الميتة باستخدام صبغة الصلاحية.

إثراء الخلايا المناعية عن طريق البوابات على مجموعات CD45 الإيجابية. حدد البلاعم المقيمة في الكلى على أنها خلايا CD11b + F4 / 80hi داخل بوابة CD45 الإيجابية كما هو موضح في استراتيجية البوابات. حدد مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة على أنها خلايا وسيطة CD11b + CD45 ، وقم بإجراء التحليل النهائي.

لوحظ وجود شريط بروتين بارز واحد بالقرب من 54 كيلودالتون في هلام صفحة SDS ، مما يؤكد النقاء والوزن الجزيئي المتوقع للإنترميديليسين المؤتلف. أظهر الإنترميديليسين المنقى نشاطا انحلاليا قويا بطريقة تعتمد على الجرعة ، حيث حقق تحلل خلايا الدم الحمراء بنسبة 50٪ عند 7.24 نانوجرام لكل مليلتر ، وتحلل كامل تقريبا عند 650 نانوجرام لكل مليلتر. أكد تحليل قياس التدفق الخلوي استنفادا ناجحا وانتقائيا للبلاعم الكلوية في الفئران البشرية المحفزة CD59 cre-R بعد يوم واحد من إعطاء intermedilysin ، مع عدم وجود استنفاد في الفئران الضابطة.

بدأت البلاعم الكلوية في إعادة التوطين بحلول اليوم الثالث ، وتعافت إلى ما يقرب من 88٪ من سكانها الأصليين بحلول اليوم السابع. عبرت 5٪ فقط من البلاعم الكلوية المتجددة حديثا عن CD59 البشري بحلول اليوم السابع ، مما يشير إلى أن إعادة التوطين حدثت بشكل أساسي عن طريق تجنيد الخلايا الأحادية بدلا من الانتشار في الموقع.