لطخة النقاط الخالية من الخلايا كمنصة مقايسة مناعية عملية وقابلة للتكيف للكشف عن استجابة الأجسام المضادة في الأمصال البشرية والحيوانية

يوضح هذا البروتوكول تقنية الدم النقطي الخالي من الخلايا ، وهي منصة فحص مناعي قابلة للتكيف ويمكن الوصول إليها وبأسعار معقولة تم تطويرها استجابة لوباء COVID-19. تتضمن طرق المقايسة المناعية القياسية الذهبية الحالية اختلافات في تقنية ELISA ومقايسات التدفق الجانبي. كان هناك اهتمام كبير بتطوير مقايسة مناعية جديدة باستخدام تقنيات مثل البروتينات المنقسمة المبلغ عنها ، والواجهات الكهروكيميائية ، والجسيمات النانوية الغروية.

يكمن التحدي في أن معظم المقايسة المناعية القياسية الذهبية لا يمكن الوصول إليها من قبل المجتمعات غير المركزية بسبب الاعتماد على المكونات والمعدات الجزيئية باهظة الثمن والمتطورة. يمكن تكييف تقنية المقايسة المناعية الجديدة CFDB هذه بسرعة مع تفشي المرض الناشئ. يستخدم معدات المختبرات الأساسية ويعتمد كليا على المكونات الجزيئية التي يمكن إنتاجها داخليا وفي بيئات منخفضة الموارد.

للبدء ، احصل على تسلسل البروتين من قاعدة بيانات UniProt باستخدام رمز الانضمام P0DTC9. التعليمات البرمجية على تحسين التسلسل للتعبير المستند إلى ecoli باستخدام كود IDT على أداة التحسين. أدخل التسلسل المحسن في قالب SnapGene للتعبير الأساسي لبناء التعبير قبل طلب التسلسل المحسن للتوليف التجاري كجزء واحد من الحمض النووي تقطعت به السبل معلق في الماء.

قم بإجراء اختبار تعبير أولي بمقياس خمسة ميكرولتر عن طريق إضافة 10٪ منتج PCR إلى تفاعل ecoli BL21 الخالي من الخلايا في أنبوب PCR. احتضان التفاعل دون اهتزاز عند 30 درجة مئوية لمدة 15 ساعة. قم بتقييم جودة التعبير عن بروتين النوكليوكابسيد أو مستضد NP عن طريق تحميل ميكرولتر واحد من التفاعل الخالي من الخلايا على هلام صفحة SDS بنسبة 12٪ ونقله إلى غشاء النيتروسليلوز للبقعة الغربية.

قم بتجميع تفاعل خال من الخلايا بمقياس مليلتر واحد باستخدام منتج قالب التعبير الخطي المنقى 15 نانومولار لمقايسة اللطخة النقطية الخالية من الخلايا احتضان خليط التعبير في أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 مليلتر مع الاهتزاز عند 80 دورة في الدقيقة لمدة 15 ساعة عند 30 درجة مئوية. بعد تقييم جودة التعبير باستخدام اللطخة الغربية واقتباس 50 ميكرولترا من خليط التعبير ، قم بتخزين الحصص عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. استخدم صورة شبكة رئيسية كما هو موضح تتميز بنمط ستة × ستة سنتيمترات يحتوي على دائرة 12 × 12 لكل منها قطر ملليمترين مصمم لتتناسب مع قدرة اكتشاف صفيحة 96 بئرا.

بعد طباعة الشبكة الرئيسية ، قم بشطيرة الشبكة المطبوعة بإحكام بين طبقتين من فيلم سقف لوحة PCR اللاصقة ، وقم بقص الساندويتش حسب الحجم على طول حدود الشبكة الخارجية. باستخدام لكمة خزعة بملليمترين ، قم بتفريغ كل دائرة ملحوظة على الشبكة. قم بقص قطعة من غشاء النيتروسليلوز مقاس 6.5 × 6.5 سم ، وضعها تحت الشبكة الرئيسية على سطح نظيف ، وثبتها باستخدام شريط لاصق.

باستخدام قلم تحديد ، ضع علامة على مواضع الدائرة الخارجية على غشاء النيتروسليلوز لاستخدامها كدليل لقطع الغشاء بعد اكتشاف العينة. خفف عينات المصل من واحد إلى 10 في PBS. باستخدام ماصة دقيقة، قم بتوزيع أحجام 0.4 ميكرولتر ثلاث مرات من كل عينة على غشاء النيتروسليلوز في مواضع الشبكة المحددة مسبقا.

اترك العينات المرقطة تلتصق وتجف في درجة الحرارة المحيطة لمدة 10 دقائق. باستخدام الملقط ، استرجع غشاء النيتروسليلوز بعناية واقطعه على طول الدوائر الخارجية المحددة. انقل الغشاء إلى طبق بتري بطول 10 سم يحتوي على 10 مل من محلول الحظر.

احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع رجها برفق عند 100 دورة في الدقيقة. قم بإزالة 50 ميكرولتر من خليط التعبير عن المستضد الخالي من الخلايا من الفريزر ، وبعد الذوبان ، أضفه إلى خمسة ملليلتر من محلول المنع في طبق بتري 10 سم. انقل الغشاء مباشرة إلى هذا المحلول المحتوي على المستضد واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، مع رجه عند 100 دورة في الدقيقة.

بعد ساعة واحدة ، اشطف واغسله الغشاء في TBST الذي يحتوي على 0.05٪ Tween 20. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 10 ميكروغرام لكل مليلتر من SpyCatcher المنقى ، واثنين من البروتين ، إلى الغشاء ، وضع الغشاء في طبق يحتوي على قمة SpyCatcher. احتضان لمدة ساعة مع الرج عند 100 دورة في الدقيقة بعد شطف الغشاء بمحلول ملحي مخزن ثلاثي أو TBS يغسل مرتين لمدة خمس دقائق في TBST متبوعا بشطف أخير في TBS.

قم بلصق قطعة من البارافيلم وثبتها على سطح عمل نظيف بالقرب من أداة تصوير اللطخة. قم بإزالة السائل الزائد عن طريق النقر على الغشاء واستخدام الملقط ، ضعه فوق البارافيلم. أضف على الفور ثلاثة ملليلتر من محلول التلألؤ الكيميائي المحسن أو محلول ECL أعلى الغشاء واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 ثانية بالضبط.

بعد تجفيف الغشاء بالصنبور ، انقله إلى أداة تصوير متوافقة مع التلألؤ الكيميائي. استخدم وظيفة تحليل الصور الخاصة بالأداة للحصول على شدة موضعية بما في ذلك ثلاثة مواضع فارغة على غشاء النيتروسليلوز. حافظ على حجم قياس ثابت لكل بقعة.

قم بتصدير البيانات إلى جدول بيانات ، مما يضمن التسمية الصحيحة لكل موضع موضعي. احسب المتوسط والانحراف المعياري لشدة البقع الثلاثية. اطرح خلفية غشاء النيتروسليلوز من جميع قياسات العينة.

بعد ذلك ، استخدم المعادلة المعطاة للحصول على قيمة فاصلة لتفسير النتائج الإيجابية أو السلبية. أخيرا ، ارسم البيانات المطروحة في رسم بياني شريطي. تم إجراء مقايسة لطخة نقطية خالية من الخلايا على سارة البشرية التجارية المميزة مسبقا ، ويتم عرض صورة للبقعة ، جنبا إلى جنب مع مخطط شدة الإشارة المقابل ، في هذا الشكل.

نجح اختبار اللطخة النقطية الخالية من الخلايا في تحديد جميع عينات التحكم السلبية ومعظم العينات الإيجابية. حدد الاختبار المستقل لمقايسة اللطخة النقطية الخالية من الخلايا في المختبر الوطني لعلم الأحياء الدقيقة بشكل صحيح جميع عينات المرضى ال 12 السلبية و 12 العينة الإيجابية ، مما يؤكد قوتها. اكتشف اختبار اللطخة النقطية الخالية من الخلايا أيضا استجابات الأجسام المضادة في الهامستر المصاب بفيروس SARS-CoV-2 سارة ، مع ملاحظة إشارات إيجابية في 18 من أصل 24 عينة بعد الإصابة تم جمعها بعد خمسة أيام من إعادة الإصابة بينما ظلت جميع عينات ما قبل الإصابة سلبية.