عزل وتثبيت وتوصيف كريات البيض في الكلى ذات الرأس الذهبي للدنيس عن طريق قياس التدفق الخلوي

يوحد هذا البروتوكول عزل وتثبيت وتقييم صلاحية الكريات البيض من كلية رأس الدنيس عن طريق قياس التدفق الخلوي ، مما يتيح معالجة عينات عالية الإنتاجية دون المساس بالجودة.

التقنيات التقليدية مثل العد اليدوي للخلايا باستخدام غرف نيوباور ومسحات الدم الملطخة شائعة في مناعة الأسماك. أصبح قياس التدفق الخلوي شائعا ، لكن تطبيقه في دراسات الأسماك لا يزال محدودا. طرق مناعة الأسماك التقليدية كثيفة الكبد وعرضة للأخطاء. تقتصر الدراسات التي أجريت على الصغيرة بسبب التحديات في الحصول على الكريات البيض النقية والحاجة إلى تقييم فوري للبقاء ، مما يحد من إنتاجية العينة.

يتيح هذا البروتوكول تحليلا مفصلا للخلايا المناعية من خلال تحديد مجموعات الكريات البيض الرئيسية والتمييز بين الخلايا الحية والخلايا الميتة. يحافظ التثبيت على الجدوى لمدة شهر ، مما يسمح بسير عمل قياس التدفق الخلوي القابل للتطوير والمرن والفعال.

تعمل النتائج التي توصلنا إليها على تعزيز مناعة الأسماك من خلال الكشف عن آليات المناعة والتأثيرات البيئية على بقاء الخلايا ، مما يساعد على تطوير استراتيجيات محسنة لإدارة الأمراض في تربية الأحياء المائية.

[الراوي] في البداية، يجب أن تتأقلم الدنيس اليافع المذهب في أنظمة إعادة تدوير أنظمة الاستزراع المائي حيث يتم ترشيح المياه وإعادة تدويرها باستمرار للحفاظ على بيئة مستقرة. تأكد من أن النظام يشتمل على الترشيح الميكانيكي والبيولوجي والتهوية والتحكم في درجة الحرارة للحفاظ على المعلمات اللاأحيائية المثلى. اضبط العوامل البيئية مثل فترة الصورة ودرجة الحرارة والملوحة ودرجة الحموضة ومستويات الأكسجين المذاب وفقا للاحتياجات المحددة للدراسة. استخدم شبكة لنقل أسماك الدنيس المذهبة برفق إلى حاوية تخزين مؤقتة مملوءة بمياه الخزان. بعد القتل الرحيم للسمكة ، ضع سمكة واحدة على جانبها على صينية تشريح معقمة. باستخدام مشرط ، قم بعمل شق دقيق على طول خط الوسط البطني للأسماك من فتحة التهوية باتجاه الخياشيم. استخدم مقص التشريح لتمديد الشق وفضح الأعضاء الداخلية. حدد موقع كلية الرأس ، التي تقع خلف الخياشيم مباشرة بالقرب من المنطقة الظهرية الأمامية من تجويف الجسم ، وتمتد على طول الجانب العلوي أسفل العمود الفقري. باستخدام زوج من الملقط والمقص ذي الرؤوس الدقيقة ، قم بإزالة الأنسجة المحيطة بعناية لتصور كلية الرأس بشكل أفضل. ثم ارفع كلية الرأس وقم بعمل جروح دقيقة حولها لتحريرها من الأنسجة المحيطة. ضع كلية الرأس المستأصلة على الفور في مصفاة خلوية موضوعة داخل طبق بتري معقم. ماصة ملليلترين من محلول الملح المتوازن من هانكس ، أو HBSS ، في طبق بتري معقم. نقع كلية الرأس المستأصلة على مصفاة الخلية باستخدام مكبس المحقنة لتحرير الخلايا في المحلول. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول متوسط تدرج الكثافة. ماصة 600 ميكرولتر من المحلول المتوسط المتدرج للكثافة في أنابيب البوليسترين ذات القاع المستدير سعة خمسة ملليلتر. انقل ببطء ملليلترين من تعليق الخلية من طبق بتري إلى كل أنبوب. جهاز طرد مركزي عند 400 جرام لمدة 45 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع إيقاف تشغيل الفرامل. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الأنبوب ومراقبة حلقة الكريات البيض. ثم استخدم ماصة باستور معقمة لنقل ما يقرب من 100 ميكرولتر من حلقة الكريات البيض برفق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر. الآن ، قم بتكوين الحجم إلى ملليلترين باستخدام HBSS وأعد تعليق الخلايا برفق. الطرد المركزي العينة على حرارة 400 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، تخلص بعناية من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات الموجودة في قاع الأنبوب. ثم, أعد تعليق الحبيبات المنقاة في مليلتر واحد من HBSS حتى يصبح تركيز الخلية النهائي بين 10,000 إلى مليون خلية لكل مليلتر. أضف 50 ميكرولترا من ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى قارورة تحتوي على الصبغة التفاعلية. بعد ضبط كثافة الخلية إلى مليون خلية لكل مليلتر ، قم بنقل مليلتر واحد من تعليق الخلية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة ملليلتر. قم بإعداد عينات التحكم في الجدوى على النحو المعطى. إحداث موت الخلايا في الأنبوبين الثالث والرابع عن طريق وضعها في حمام مائي عند 70 درجة مئوية لمدة سبع دقائق. لتلطيخ الخلايا ، قم بتقطيع ميكرولتر واحد من صبغة الفلورسنت المعاد تكوينها إلى الأنبوبين الثاني والرابع اللذين يحتويان على ملليلتر واحد من تعليق الخلية واخلطهم جيدا. احتضان الأنابيب الملطخة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، محمية من الضوء. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين بمليلتر واحد من HBSS ، وأعد تعليق الحبيبات النهائية في 900 ميكرولتر من نفس المخزن المؤقت. ثم ماصة 100 ميكرولتر من 37٪ فورمالديهايد لإصلاح الخلايا ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد غسل الخلايا مرتين بمليلتر واحد من HBSS يحتوي على 1٪ BSA ، أعد تعليقه في مليلتر واحد من نفس المحلول. قم بتخزين العينات عند أربع درجات مئوية في الثلاجة لمدة تصل إلى شهر واحد. ضع أنبوب العينة الثابت في منفذ عينة مقياس التدفق الخلوي للتحليل. سجل ما لا يقل عن 10,000 حدث لكل عينة داخل بوابة المفردات. احفظ جميع البيانات وقم بنسخها احتياطيا على محركات أقراص خارجية أو تخزين سحابي. تصور بيانات قياس التدفق الخلوي عن طريق رسم منطقة التشتت الأمامية مقابل منطقة التشتت الجانبية لتقييم حجم الخلية وحدبتها. قم بإجراء بوابات خلية مفردة واستبعاد المضاعفات عن طريق رسم منطقة التشتت الأمامية مقابل ارتفاع التشتت الأمامي. تحديد مجموعات الكريات البيض الثلاثة بناء على ملامح التشتت الأمامية مقابل الجانبية. اضبط عتبة تلطيخ صبغة الجدوى في قناة التألق المقابلة للتمييز بين الخلايا الحية والميتة. في ظل الظروف المثلى ، شكلت الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة والخلايا الحبيبية 31٪ و 38٪ و 31٪ من سكان الكريات البيض على التوالي ، بينما تحت الإجهاد الحراري ، انخفضت الخلايا الليمفاوية إلى 21.3٪ ، وزادت الخلايا الوحيدة إلى 45.6٪ ، وظلت الخلايا المحببة مستقرة عند 33.1٪. أظهرت العينة المعرضة للظروف المثلى قابلية أعلى للحياة ، مع غلبة الخلايا الحية عبر جميع مجموعات الكريات البيض. في المقابل ، أظهرت العينة المجهدة حراريا زيادة كبيرة في موت الخلايا.