التنظيم الكيميائي الوراثي في الخلايا السليفة المشتقة من الخلايا الجذعية المعاد برمجتها في علاج الأمراض التنكسية العصبية

يركز بحثنا على توضيح الآلية المسببة للأمراض الكامنة وراء المرض التنكسي العصبي ، مع دمج التقنيات المتقدمة لتطوير تقنيات العلاج الخلوي الفعالة للتطبيقات السريرية. قام عملنا الأخير بزرع الخلايا الجذعية المعدلة كيميائيا في نماذج الفئران لمرض باركنسون. نقوم بتعديل أنشطة الخلايا العصبية لخلية واحدة باستخدام أدوية مصممة ، لذلك المراقبة الفيزيولوجية الكهربية والتقييم السلوكي. نحن نستخدم كريسبر بشكل أساسي للهندسة الوراثية ، والفيزيولوجيا الكهربية لمراقبة النشاط العصبي ، والمقايسة السلوكية لتقييم استعادة الوظيفة في نماذج مرض باركنسون. ترتفع كفاءة خلايا الكسب غير المشروع عند المؤشر المناسب والبقاء على قيد الحياة والمساهمة الوظيفية في الأنسجة المضيفة في العلاج القائم على الخلايا الجذعية ، وعلاج الأمراض التنكسية العصبية. النشاط الخلوي غير المنضبط المرتبط بالعواقب السلبية ، بما في ذلك تكوين الورم.

توفر الاستفادة من التكنولوجيا في الخلايا الجذعية البشرية المعاد برمجتها والخلايا العصبية الدافعة الوسائل للتحكم بدقة في الأنشطة العصبية عن طريق إعطاء عقار CNO المصمم

[مدرب] للبدء ، امزج برفق من 50 إلى 100 نانوجرام من المتجه الخطي ، وقم بتقطيع واحد وجزء اثنين ، بنسبة واحد إلى ثلاثة إلى ثلاثة مولار ، جنبا إلى جنب مع مزيج الاستنساخ 2X. احتضان الخليط عند 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لتسهيل إعادة التركيب المتماثل باستخدام تجميع جيبسون. أدخل دليل الحمض النووي الريبي الذي يستهدف موقع AAVS1 في موقع BBS1 لمتجه PX458. الحفاظ على الخلايا الجذعية المعاد برمجتها في وسط الاستزراع ، بهدف كثافة خلية تتراوح بين 2 إلى 5 ملايين خلية لكل مليلتر. الآن ، امزج من اثنين إلى 5 ملايين خلية ، وميكروغرامين من كل بلازميد متبرع ، وميكروغرامين من بلازميد GRNA في 100 ميكرولتر من مخزن التثقيب الكهربائي. انقل خليط الخلية والبلازميد إلى كوفيت لإجراء التثقيب الكهربائي. بعد ذلك ، انقل الخلايا الكهربائية إلى ألواح مكونة من ستة آبار تم تغليفها ب poly-D-lysine واللامينين. توزيع ما يقرب من 500,000 خلية لكل بئر في ملليلترين من وسط الاستزراع. بعد 72 ساعة من التثقيب الكهربائي ، استخدم مقياس التدفق الخلوي لفرز الخلايا الموجبة الفلورسنت. قم بتكوين فارز باستخدام قناة FITC لاكتشاف ZsGreen. قم بتضمين الخلايا الجذعية العصبية المستحثة غير المعالجة كعناصر تحكم سلبية لتحديد التألق الأساسي. صفيحة مفردة ZsGreen-الخلايا الإيجابية إلى 96 لوحة بئر مغلفة مسبقا ب poly-D-lysine واللامينين وإضافة 200 ميكرولتر من وسط الثقافة لكل بئر. حافظ على المزرعة لمدة سبعة إلى 14 يوما. اعزل المستنسخة المفردة التي تظهر التألق باستخدام مجهر مضان مقلوب مزود بمجموعة مرشحات بروتين فلوري أخضر. بعد توسيع الخلايا الموجبة على ألواح مغلفة من 48 بئرا ، قم بتقسيمها إلى قسمين ، أحدهما للاستزراع المستمر والآخر للتنميط الجيني. استخراج الحمض النووي الجيني من المستنسخة المرشحة. قم بإعداد مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام إصلاحين أساسيين ، أحدهما لتأكيد إدخال الجين المعني ، والآخر للتمييز بين المستنسخة متماثلة اللواقح وغير متغايرة الزيجوت. هضم الخلايا واغسلها في PBS وجهاز الطرد المركزي عند 250 جم لمدة ثلاث دقائق. إجراء حقن تجسيمية أحادية الجانب من ثلاثة ميكرولتر من 6-هيدروكسي دوبامين بتركيز خمسة ميكروغرام لكل ميكرولتر على المخدر. استهدف الجسم المخطط الأيمن باستخدام الإحداثيات الصحيحة. يجب إعطاء حقنة داخل الصفاق من الأبومورفين بمعدل ملليغرام واحد لكل كيلوغرام باستخدام محلول 0.5 ملليغرام لكل مليلتر مذاب في محلول ملحي بعد أربعة أسابيع من الجراحة للتحقق من صحة الآفات. قم بإعطاء حقنة تجسيمية لأربعة ميكرولترات من معلق الخلية المحضر في نموذج الفأر لمرض باركنسون. قم بإجراء اختبار الأسطوانة في نقاط زمنية متعددة بعد زرع الخلايا. ضع دورق زجاجي بقطر 20 سم وارتفاع 30 سم على سطح مستو غير عاكس. بعد ذلك ، ضع كاميرا الرؤية العلوية فوق الأسطوانة لالتقاط القطر الكامل. ضع كل ماوس في وسط الأسطوانة وابدأ تسجيل الفيديو المتزامن لمدة ثلاث دقائق لكل جلسة. بعد الجلسة ، أعد الماوس إلى قفص منزله. تقييم حركة الطرف العلوي للفئران خلال جلسة مدتها ثلاث دقائق. احسب عدد ملامسات الجدار التي يجريها الطرف الأمامي الضعيف بالنسبة لإجمالي جهات الاتصال التي يتم إجراؤها بواسطة كلا الطرفين الأماميين. يجب تطبيق إما محلول ملحي أو أكسيد Clozapine N-بجرعة 1.2 ملليغرام لكل كيلوغرام عن طريق الحقن داخل الصفاق. قم بإجراء اختبار الأسطوانة مرة أخرى لتقييم التعديل السلوكي في نموذج فأر مرض باركنسون بعد إعطاء أكسيد N كلوزابين. بعد استخراج الدماغ من المخدر ، ووضعه على الفور في السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي القائم على السكروز المثلج للحفاظ على سلامة الخلايا باستخدام الاهتزاز ، قم بتقطيع الدماغ إلى أقسام بسماكة 300 إلى 400 ميكرومتر. اضبط إعدادات إدخال الغاز لتتوازن مع 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 34 درجة مئوية. انقل شرائح الدماغ إلى غرفة مملوءة بالسائل النخاعي الاصطناعي. قم بتحميل الماصات الزجاجية بمحلول مثلج داخل الخلايا، مما يضمن مقاومة القطب الكهربائي بين سبعة إلى 10 ميغا أوم. قم بتركيب الشرائح في غرفة تسجيل مغمورة بدرجة كبيرة بسرعة ملليلترين في الدقيقة مع السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي المؤكسج عند 34 درجة مئوية. ضع الماصات باستخدام أجهزة المعالجة الدقيقة الآلية تحت الفحص المجهري للتداخل التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء. قم بإنشاء تكوين خلية كاملة باستخدام شفط لطيف لتصحيح الخلايا العصبية ذات المقاومة التي تزيد عن جيجا أوم واحد. قم بتثبيت الخلايا عند 70 مللي فولت تحت الصفر باستخدام مضخم مشبك التصحيح واحصل على تيارات استثارية تلقائية تلقائية بعد التشابك لمدة ثماني دقائق بمعدل أخذ عينات 10 كيلو هرتز. أضف 50 ميكرومولار من أكسيد N كلوزابين إلى غرفة التسجيل مباشرة بعد قياس خط الأساس. استمر في تسجيل البيانات لمدة 16 دقيقة وراقب التغيرات في تردد أو سعة التيار المثير التلقائي بعد التشابك. أخيرا ، قم بإجراء الغسيل عن طريق استبدال محلول أكسيد الكلوزابين N بسائل دماغي نخاعي صناعي جديد واستمر في التسجيل لتقييم التعافي في النشاط المشبكي. أدى التعديل الدموي الوراثي باستخدام أكسيد N كلوزابين إلى تقليل حركة الطرف الأمامي المقابل في الفئران المزروعة ب hM4Di وزادها في الفئران المزروعة ب hM3Dq مقارنة بالعلاج الملحي ، مما يدل على التحكم السلوكي ثنائي الاتجاه. كشفت التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية أن الخلايا المزروعة ب hM4Di لها فترات أطول وسعوات ذروة أصغر في التيارات المثيرة التلقائية بعد التشابك ، في حين أن الخلايا المزروعة hM3Dq لها فترات أقصر وسعات أكبر ، مما يشير إلى قمع وتعزيز النشاط المشبكي. أكد تحليل التألق المناعي التعبير في الجسم الحي عن هيدروكسيلاز التيروزين و ZsGreen في خلايا hM4Di و hM3Dq المزروعة ، مما يدعم تكامل الكسب غير المشروع الناجح.