تجميع المفاعلات الحيوية للاستزراع المستمر لمجتمعات البراز المعقدة

ندرس تفاعلات البكتيريا المضيفة وكيف تؤثر العوامل الداخلية والخارجية على الصحة ، مع التركيز على التأثيرات البكتيرية على تطور السرطان وتطوره والاستجابة للعلاج. درسنا مثبطات نقاط التفتيش المناعية المضادة ل PD-1 في المجتمعات البكتيرية ، ووجدنا أن المستقلبات البكتيرية تعزز فعالية العلاج المضاد ل PD-1.

يعد عزل تأثير عوامل المضيف على الميكروبيوم في الجسم الحي أمرا صعبا بسبب التأثيرات المتعددة. تسمح مصفوفة المفاعلات الحيوية الدقيقة بالفحص الخاضع للرقابة لعمليات محددة ، مما يوضح آثارها المباشرة على المجتمعات الميكروبية. يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة من حيث التكلفة لزراعة مجتمعات البراز في ظل ظروف خاضعة للرقابة مع تمكين الباحثين من إجراء التجارب بالتوازي بسرعة نسبيا.

[مدرب] للبدء ، احصل على مجموعة مفاعلات مطبوعة ثلاثية الأبعاد من ستة آبار. قم بقص اثني عشر شريطا مقاس 25 ملم من أنابيب PTFE مقاس 1/8 بوصة واستخدم ماكينة حلاقة لحلاقة الأطراف. أدخل أحد طرفي كل شريط في فتحة الخيط اللولبي لذكر Luer مع تركيب من 25 إلى 28 خيطا. قم بربط التركيبات بإحكام في النفايات المخصصة وفتحات العينة الخاصة بالمصفوفة. الآن ، أدخل قضيب التحريك الدقيق في كل بئر مفاعل. قم بربط خيط ذكر 1 / 4-28 يتم تركيبه في فتحات المصدر لكل بئر مفاعل. تركيبات محول شريط خرطوم Luer الأنثوية في تركيبات الخيط لتوصيلات النفايات والمصدر لكل بئر مفاعل. ثم قم بربط تركيبات محول الخرطوم الشائكة بمقدار 3-32 / 2 بوصة في تركيبات الخيط 1 / 4-28 لمنافذ العينة. ضع حاجزا مطاطيا فوق محولات الخرطوم الشائكة وقم بطي الجزء العلوي. بعد ذلك ، قم بقص مجموعتين من أنابيب E-LFL 2.06 ملم لخطوط النفايات والمصدر. استخدم الماء الساخن لتنعيم الأنبوب لتسهيل التوصيق. قم بتوصيل الأنبوب بتركيبات محول الخرطوم الشائكة Luer X الأنثوي مقاس 1/8 بوصة لتوصيلات المصدر والنفايات. الآن قم بإصلاح ذكر Luer بحلقة قفل X إلى 1/8 بوصة خرطوم محول شوكة مناسب للطرف الآخر من الأنبوب. قم بربط محول خرطوم Luer X إلى 1/16 بوصة مناسبا فيه. قم بتوصيل الأنبوب ذو الوقفين بالحجم المناسب بالمصدر المقابل وتوصيلات النفايات. ثم قم بإصلاح أنثى أخرى Luer X إلى 1/16 بوصة خرطوم محول شوكة مناسب للطرف الآخر من الأنبوب. بعد تكرار ذلك لجميع تركيبات المصدر والنفايات ، أدخل لوير ذكر مع حلقة قفل X إلى تركيبات محول خرطوم شائكة 1/8 بوصة إلى قطعة من أنبوب E-LFL 2. قم بتوصيل أحد طرفي الأنثى Luer X غير المأهولة إلى محول خرطوم شوكة 1/16 بوصة في نهاية كل قسم من أقسام الأنابيب ذات التوقفين لجميع القطع. بعد تكرار ذلك لجميع تركيبات المصدر والنفايات ، قم بتوصيل أنبوب E-LFL 2.06 ملم لخطوط مصدر بئر المفاعل الأول والثاني ، باستخدام طرفي نقيض من أنثى Luer T. ثم قم بإصلاح قطعة من الأنابيب التي يبلغ طولها خمسة سنتيمترات باستخدام ذكر Luer مع حلقة قفل X إلى تركيبات محول 1/8 بوصة على كل طرف إلى المخرج الأوسط ل T ، مما يؤدي إلى تقاطع T ثان. الآن قم بتوصيل أنبوب المصدر E-LFL 2.06 ملم للمفاعل الثالث بالجانب الآخر من T. قم بإرفاق مقطع أنابيب آخر بطول خمسة سنتيمترات يحتوي على لوير ذكر مع حلقة قفل X إلى محول 1/8 بوصة من أحد طرفيه وأنثى لور مع حلقة قفل X إلى محول 1/8 بوصة من جهة أخرى. بعد ذلك ، قم بتوصيل Luer ذكر مع حلقة قفل X بمحول شوكة خرطوم 1/8 بوصة مناسب لأحد طرفي قطعة 25 سم من أنبوب E-LFL 2.06 ملم. قم بتثبيت أنثى Luer X إلى 1/8 بوصة محول شائكة خرطوم مناسب للطرف الآخر وقم بتغطيته بورق الألمنيوم. لتجميع زجاجة جمع النفايات ، قم بتثبيت غطاء من فتحتين بشكل غير محكم على زجاجة سعة لترين. أدخل تركيبات الخيط الذكور 1 / 4-28 في كلا فتحتي الغطاء. ثم قم بتوصيل أنثى Luer بمحول شوكة خرطوم 1/8 بوصة بتركيب الخيط الذكري الذي لا يتصل بأنبوب PTFE المرفق مسبقا في الغطاء. قم بتوصيل قطعة من أنبوب E-LFL 2.06 ملم بطول خمسة سنتيمترات بمحول شوكة الخرطوم الموجود على الزجاجة. قم بتوصيل Luer ذكر مع حلقة قفل X إلى محول شوكة خرطوم 1/8 بوصة بالطرف الآخر من الأنبوب قبل تغطيته بورق الألمنيوم. أخيرا ، قم بتغطية غطاء الزجاجة بالكامل بورق الألمنيوم قبل التعقيم عند 121 درجة مئوية و 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 45 دقيقة. بمجرد اكتمال التعقيم ، قم بإحكام ربط التركيبات وأختام الرقائق وضع المفاعلات في غرفة لاهوائية لمدة 48 ساعة قبل الاستخدام. قم بمحاذاة مصفوفة المفاعل داخل الغرفة اللاهوائية فوق لوحة تحريك مغناطيسية مضبوطة على 1,600 دورة في الدقيقة. ثم قم بتركيب الأنبوب ذو الشوطين لكل من خطوط المصدر والنفايات في المشابك الموجودة على المضخات التمعجية المقابلة. قم بقفل المشابك في مكانها إذا تم ذلك قبل أقل من 25 ساعة من الاستخدام. خلاف ذلك ، اتركه فضفاضا لتقليل تآكل الأنبوب. الآن قم بإزالة غطاء القصدير من زجاجة المصدر. قم بربط التركيبات في تركيبات الخيط الذكور Luer إلى 1 / 4-28 ، مما يضمن توصيل هذه الفتحات بأنبوب PTFE الداخلي. قم بإزالة أغطية الرقائق ، وقم بتوصيل مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر بخط التهوية البالغ طوله خمسة سنتيمترات لكل من زجاجة المصدر وزجاجة النفايات. ابدأ التدفق بمعدل معتدل لبدء ملء المفاعل. تأكد من وضع أنبوب محيط الخصر داخل كل بئر مفاعل أقل من أنبوب المصدر لمنع الإفراط في الملء أو التفريغ الكامل لكل بئر. عندما تبدأ المفاعلات في الامتلاء ، تأكد من أن جميع الآبار تصل إلى نفس الحجم وأن الوسائط تتدفق إلى محيط الخصر قبل مغادرة المفاعلات للتفريغ طوال الليل. ابدأ بنقل المواد التجريبية إلى الغرفة اللاهوائية لمدة 24 ساعة. بعد حساب كمية لقاح البراز المطلوب ، انقل عينات البراز المحفوظة في قوارير مبردة إلى الغرفة اللاهوائية واتركها تذوب لمدة 15 دقيقة. باستخدام طرف ماصة عريض التجويف، انقل المادة البرازية من قوارير مبردة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. قم بالطرد المركزي للأنبوب المغلق عند 200 جم لمدة خمس دقائق لتسوية الجسيمات. انقل الأنابيب مرة أخرى إلى الغرفة اللاهوائية. ثم قم بإزالة المادة الطافية. استخدم ملعقة مختبرية الأوتوكلاف لنقل 5.7 جرام من المواد الصلبة البرازية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. أضف 17.1 مل من المحلول الملحي المعقم اللاهوائي إلى الأنبوب وأغلقه بإحكام. الآن قم بدوامة الأنبوب لمدة خمس دقائق قبل الطرد المركزي كما هو موضح سابقا. استخدم مناديل مختبرية مبيضة بنسبة 10٪ لتعقيم الحاجز أعلى كل مفاعل لمدة دقيقتين على الأقل. بعد إعادة العينات إلى الغرفة اللاهوائية ، قم بإخراج المادة الطافية إلى أنابيب مخروطية جديدة سعة 50 ملليلترا. الآن انقل 3.8 مل من الملاط البرازي إلى ست محاقن منفصلة سعة خمسة ملليلتر مزودة بإبر قياس 16 بوصة مقاس 1.5 بوصة. قم بإزالة منديل التبييض من حاجز المفاعل. ثم أدخل الإبرة من خلال الحاجز وحقن 3.8 مل من الملاط البرازي ببطء في كل مفاعل قبل مغادرة المفاعلات للجلوس طوال الليل. بعد حضانة لمدة 16 إلى 18 ساعة ، ابدأ التدفق إلى المفاعل. اضبط لوحة التحريك المغناطيسية على أقصى سرعة فور حقن الملاط البرازي. تغيرت تركيبة المجتمع الميكروبي في كلا المفاعلين المكررين بمرور الوقت مع ظهور الأنواع المختلفة وفرة نسبية متغيرة عبر الأيام. تم اكتشاف البكتيريا اللاهوائية الحساسة ، مثل أجناس المطثية ، باستمرار في كل مفاعل في جميع النقاط الزمنية.